 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 10962 | 回復(fù): 12 | ||
安群星新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
一對(duì)引物擴(kuò)增，出現(xiàn)兩條帶 已有5人參與
|
| 大家好，小弟最近碰到問題，請(qǐng)大家?guī)蛶兔鉀Q一下。情況是這樣的，我用的是Takara的一個(gè)載體，在載體上連接了我的目的片段1200bp左右。轉(zhuǎn)化后，用該載體的通用引物擴(kuò)增，出現(xiàn)了兩條帶，一條1200bp左右（可能就是我的目的帶），一條3000bp左右，且這兩條帶都很暗。同時(shí)，我又用我目的片段的引物擴(kuò)增，只出現(xiàn)大小相符的目的帶。送去測(cè)序，引物為目的基因引物時(shí)，測(cè)序結(jié)果與我的目的基因序列相符，證明目的基因是插進(jìn)去了；但當(dāng)我用載體的通用引物測(cè)序時(shí)，就測(cè)不出來了。我也嘗試膠回收3000bp處的條帶鏈接T載體測(cè)序，但由于條帶很暗，膠回收后濃度很低，與T載體鏈接沒有成功。請(qǐng)各位大俠幫我分析下。不甚感激 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有203人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有15人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 測(cè)序結(jié)果少了500bp可是PCR結(jié)果完全正確
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 眼下在做關(guān)于青枯病的課題 出了問題難以解決
已經(jīng)有7人回復(fù)
- RACE 基因克隆 出現(xiàn)兩條帶
已經(jīng)有4人回復(fù)
- PCR產(chǎn)物異常，空白對(duì)照出現(xiàn)條帶，求解！
已經(jīng)有10人回復(fù)
- RED重組敲除基因，PCR驗(yàn)證時(shí)既有目的基因條帶也有打靶片段條帶
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 酵母基因敲除，PCR驗(yàn)證遇到的問題。
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)單堿基的重疊峰
已經(jīng)有6人回復(fù)
- Vemurafenib：首個(gè)獲批的抗BRAF突變腫瘤藥
已經(jīng)有1人回復(fù)
- race-pcr技術(shù)的簡介
已經(jīng)有2人回復(fù)
- 基因工程課程小結(jié)
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 一種比較詳細(xì)的PCR技術(shù)
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【分享】熒光定量PCR簡介
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 幫忙翻譯一篇摘要，要專業(yè)的，謝謝
已經(jīng)有3人回復(fù)
winyuyuyu123
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 21 (小學(xué)生)
- 金幣: 813.3
- 紅花: 2
- 帖子: 68
- 在線: 25.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 4912791
- 注冊(cè): 2016-08-12
- 專業(yè): 病原真菌學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-12-02 21:28:17
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-12-02 21:28:17
|
污染了，挑菌時(shí)挑的不是單菌落，或者轉(zhuǎn)化時(shí)一個(gè)菌里邊轉(zhuǎn)進(jìn)去兩個(gè)質(zhì)粒。 出現(xiàn)你那種現(xiàn)象的原因： 通用引物會(huì)同時(shí)結(jié)合兩個(gè)載體，因此你擴(kuò)增會(huì)出現(xiàn)兩條帶，測(cè)序的話也會(huì)出現(xiàn)雜峰導(dǎo)致測(cè)不出來。 用你自己的引物只結(jié)合你的目標(biāo)載體，所以只能擴(kuò)增一條帶，測(cè)序也能正常測(cè)出。 解決方案： 1：現(xiàn)有菌液稀釋涂板或平板劃線，重新挑取單菌落搖菌培養(yǎng)。 2：若上述方法無法解決，可能是轉(zhuǎn)入多個(gè)質(zhì)粒，重做連接或吧之前做轉(zhuǎn)化的平板拿來重新挑單菌落檢測(cè)。 |
2樓2016-11-29 09:05:31
安群星
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 12.1
- 帖子: 16
- 在線: 10.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 4214787
- 注冊(cè): 2015-11-12
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
3樓2016-12-01 11:50:13
Alice 2016
鐵蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 10 (幼兒園)
- 金幣: 565.5
- 散金: 5
- 紅花: 3
- 帖子: 72
- 在線: 14.7小時(shí)
- 蟲號(hào): 4502093
- 注冊(cè): 2016-03-14
- 專業(yè): 生物化學(xué)
4樓2016-12-02 16:51:45
安群星
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 12.1
- 帖子: 16
- 在線: 10.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 4214787
- 注冊(cè): 2015-11-12
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
5樓2016-12-26 14:40:43
yujiaping1
木蟲 (著名寫手)
- MolEPI: 3
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 1365.2
- 散金: 10
- 紅花: 5
- 帖子: 1174
- 在線: 66.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 929883
- 注冊(cè): 2009-12-17
- 性別: MM
- 專業(yè): 疫苗學(xué)
|
你的通用引物和載體全部序列Blast一下，顯然有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，不然空載不應(yīng)該出兩條帶，排除空載體兩條帶的問題，你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)才能解決。不過你測(cè)序的結(jié)果（3000多的）如果能比對(duì)到完整的序列，且插入位點(diǎn)正確，那么我基本可以判斷，酶切連接成功，換通用引物，之前的問題就不存在了。 另外，樓上說同一個(gè)菌轉(zhuǎn)入多個(gè)質(zhì)粒，就必須重新連接，其實(shí)可以提質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化，挑單克隆。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
6樓2016-12-26 15:22:09
浮笙若夢(mèng)
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 15 (小學(xué)生)
- 金幣: 16.8
- 紅花: 2
- 帖子: 43
- 在線: 9.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 4877134
- 注冊(cè): 2016-07-28
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
7樓2016-12-26 15:35:13
安群星
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 12.1
- 帖子: 16
- 在線: 10.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 4214787
- 注冊(cè): 2015-11-12
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
8樓2016-12-29 11:42:12
安群星
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 12.1
- 帖子: 16
- 在線: 10.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 4214787
- 注冊(cè): 2015-11-12
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
|
非常感謝您的回答。 可能我的表述不是很清楚。是這樣的，我有一段目的片段，用兩端帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物連接入T載體。這時(shí)測(cè)序是拿的我擴(kuò)增的引物測(cè)序的（那時(shí)候覺得用擴(kuò)增引物測(cè)序也是可以的），測(cè)序結(jié)果表明有我的目的條帶，序列正確。然后，我開始表達(dá)載體的構(gòu)建，雙酶切構(gòu)建的T載質(zhì)粒，回收大小符合的目的片段，與經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體做連接轉(zhuǎn)化，挑取了兩株陽性克�。ㄟ@是用菌落PCR鑒定的，用的引物也是目的片段的引物），這時(shí)，詭異的出現(xiàn)了，若用目的片段擴(kuò)增引物擴(kuò)增陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，出現(xiàn)一條帶（條帶很明顯），若用表達(dá)載體的通用引物去擴(kuò)增，則出現(xiàn)兩條帶（一條3000bp左右，一條1500bp左右，我的目的條帶大小是1100bp左右，通用引物中間序列300bp左右），拿轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒測(cè)序，通用引物測(cè)不出來，目的片段擴(kuò)增引物能測(cè)出來。就是這樣的，不知道哪里出現(xiàn)問題。望大家?guī)兔ο胂朕k法，非常感謝。 構(gòu)建了不止兩次，只有兩次構(gòu)建長出了陽性克隆，挑出的轉(zhuǎn)化子都是這種情況。 |
9樓2016-12-29 11:54:03
安群星
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 12.1
- 帖子: 16
- 在線: 10.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 4214787
- 注冊(cè): 2015-11-12
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
10樓2016-12-29 11:55:46
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 安群星 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 320分，材料與化工專業(yè)，求調(diào)劑 +6 | 一定上岸aaa 2026-03-27 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +11 | 陽陽哇塞 2026-03-27 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +6 | 嗯嗯嗯嗯2 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +3 | 李嘉圖·S·路 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +8 | hanamiko 2026-03-26 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | 崔wj 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +7 | 鈕恩雪 2026-03-25 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +6 | 紅衣隱官 2026-03-21 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料考研求調(diào)劑 +3 | Dendel 2026-03-23 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 271求調(diào)劑 +6 | 生如夏花… 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿河工大 081700 276求調(diào)劑 +4 | 地球繞著太陽轉(zhuǎn) 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)339材料與化工求調(diào)劑 +3 | 江往賣魚 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿中南大學(xué)化學(xué)學(xué)碩0703總分337求調(diào)劑 +7 | niko- 2026-03-22 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +7 | 加一一九 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑，求導(dǎo)師收 +7 | 天天好運(yùn)來上岸?/a> 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 化工專碩求調(diào)劑 +3 | question挽風(fēng) 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 277分求調(diào)劑，跨調(diào)材料 +3 | 考研調(diào)劑lxh 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +3 | desto 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 306求調(diào)劑 +5 | 來好運(yùn)來來來 2026-03-22 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)070300 學(xué)碩336求調(diào)劑 +5 | vv迷 2026-03-21 | 8/400 |
|