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安群星新蟲 (初入文壇)
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[求助]
一對引物擴增，出現(xiàn)兩條帶 已有5人參與
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| 大家好，小弟最近碰到問題，請大家?guī)蛶兔鉀Q一下。情況是這樣的，我用的是Takara的一個載體，在載體上連接了我的目的片段1200bp左右。轉(zhuǎn)化后，用該載體的通用引物擴增，出現(xiàn)了兩條帶，一條1200bp左右（可能就是我的目的帶），一條3000bp左右，且這兩條帶都很暗。同時，我又用我目的片段的引物擴增，只出現(xiàn)大小相符的目的帶。送去測序，引物為目的基因引物時，測序結(jié)果與我的目的基因序列相符，證明目的基因是插進去了；但當我用載體的通用引物測序時，就測不出來了。我也嘗試膠回收3000bp處的條帶鏈接T載體測序，但由于條帶很暗，膠回收后濃度很低，與T載體鏈接沒有成功。請各位大俠幫我分析下。不甚感激 |
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winyuyuyu123
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感謝參與，應助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-12-02 21:28:17
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污染了，挑菌時挑的不是單菌落，或者轉(zhuǎn)化時一個菌里邊轉(zhuǎn)進去兩個質(zhì)粒。 出現(xiàn)你那種現(xiàn)象的原因： 通用引物會同時結(jié)合兩個載體，因此你擴增會出現(xiàn)兩條帶，測序的話也會出現(xiàn)雜峰導致測不出來。 用你自己的引物只結(jié)合你的目標載體，所以只能擴增一條帶，測序也能正常測出。 解決方案： 1：現(xiàn)有菌液稀釋涂板或平板劃線，重新挑取單菌落搖菌培養(yǎng)。 2：若上述方法無法解決，可能是轉(zhuǎn)入多個質(zhì)粒，重做連接或吧之前做轉(zhuǎn)化的平板拿來重新挑單菌落檢測。 |
2樓2016-11-29 09:05:31
安群星
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3樓2016-12-01 11:50:13
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4樓2016-12-02 16:51:45
安群星
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5樓2016-12-26 14:40:43
yujiaping1
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你的通用引物和載體全部序列Blast一下，顯然有兩個結(jié)合位點，不然空載不應該出兩條帶，排除空載體兩條帶的問題，你后續(xù)的實驗才能解決。不過你測序的結(jié)果（3000多的）如果能比對到完整的序列，且插入位點正確，那么我基本可以判斷，酶切連接成功，換通用引物，之前的問題就不存在了。 另外，樓上說同一個菌轉(zhuǎn)入多個質(zhì)粒，就必須重新連接，其實可以提質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化，挑單克隆。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
6樓2016-12-26 15:22:09
7樓2016-12-26 15:35:13
安群星
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8樓2016-12-29 11:42:12
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非常感謝您的回答。 可能我的表述不是很清楚。是這樣的，我有一段目的片段，用兩端帶有酶切位點的引物擴增，然后將PCR產(chǎn)物連接入T載體。這時測序是拿的我擴增的引物測序的（那時候覺得用擴增引物測序也是可以的），測序結(jié)果表明有我的目的條帶，序列正確。然后，我開始表達載體的構(gòu)建，雙酶切構(gòu)建的T載質(zhì)粒，回收大小符合的目的片段，與經(jīng)雙酶切的表達載體做連接轉(zhuǎn)化，挑取了兩株陽性克�。ㄟ@是用菌落PCR鑒定的，用的引物也是目的片段的引物），這時，詭異的出現(xiàn)了，若用目的片段擴增引物擴增陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，出現(xiàn)一條帶（條帶很明顯），若用表達載體的通用引物去擴增，則出現(xiàn)兩條帶（一條3000bp左右，一條1500bp左右，我的目的條帶大小是1100bp左右，通用引物中間序列300bp左右），拿轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒測序，通用引物測不出來，目的片段擴增引物能測出來。就是這樣的，不知道哪里出現(xiàn)問題。望大家?guī)兔ο胂朕k法，非常感謝。 構(gòu)建了不止兩次，只有兩次構(gòu)建長出了陽性克隆，挑出的轉(zhuǎn)化子都是這種情況。 |
9樓2016-12-29 11:54:03
安群星
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10樓2016-12-29 11:55:46
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