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安群星新蟲 (初入文壇)
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[求助]
一對引物擴增，出現(xiàn)兩條帶 已有5人參與
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| 大家好，小弟最近碰到問題，請大家?guī)蛶兔鉀Q一下。情況是這樣的，我用的是Takara的一個載體，在載體上連接了我的目的片段1200bp左右。轉(zhuǎn)化后，用該載體的通用引物擴增，出現(xiàn)了兩條帶，一條1200bp左右（可能就是我的目的帶），一條3000bp左右，且這兩條帶都很暗。同時，我又用我目的片段的引物擴增，只出現(xiàn)大小相符的目的帶。送去測序，引物為目的基因引物時，測序結(jié)果與我的目的基因序列相符，證明目的基因是插進去了；但當(dāng)我用載體的通用引物測序時，就測不出來了。我也嘗試膠回收3000bp處的條帶鏈接T載體測序，但由于條帶很暗，膠回收后濃度很低，與T載體鏈接沒有成功。請各位大俠幫我分析下。不甚感激 |
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Alice 2016
鐵蟲 (小有名氣)
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4樓2016-12-02 16:51:45
winyuyuyu123
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-12-02 21:28:17
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-12-02 21:28:17
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污染了，挑菌時挑的不是單菌落，或者轉(zhuǎn)化時一個菌里邊轉(zhuǎn)進去兩個質(zhì)粒。 出現(xiàn)你那種現(xiàn)象的原因： 通用引物會同時結(jié)合兩個載體，因此你擴增會出現(xiàn)兩條帶，測序的話也會出現(xiàn)雜峰導(dǎo)致測不出來。 用你自己的引物只結(jié)合你的目標(biāo)載體，所以只能擴增一條帶，測序也能正常測出。 解決方案： 1：現(xiàn)有菌液稀釋涂板或平板劃線，重新挑取單菌落搖菌培養(yǎng)。 2：若上述方法無法解決，可能是轉(zhuǎn)入多個質(zhì)粒，重做連接或吧之前做轉(zhuǎn)化的平板拿來重新挑單菌落檢測。 |
2樓2016-11-29 09:05:31
安群星
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3樓2016-12-01 11:50:13
安群星
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5樓2016-12-26 14:40:43
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