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安群星新蟲 (初入文壇)
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[求助]
一對(duì)引物擴(kuò)增，出現(xiàn)兩條帶 已有5人參與
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| 大家好，小弟最近碰到問題，請(qǐng)大家?guī)蛶兔鉀Q一下。情況是這樣的，我用的是Takara的一個(gè)載體，在載體上連接了我的目的片段1200bp左右。轉(zhuǎn)化后，用該載體的通用引物擴(kuò)增，出現(xiàn)了兩條帶，一條1200bp左右（可能就是我的目的帶），一條3000bp左右，且這兩條帶都很暗。同時(shí)，我又用我目的片段的引物擴(kuò)增，只出現(xiàn)大小相符的目的帶。送去測(cè)序，引物為目的基因引物時(shí)，測(cè)序結(jié)果與我的目的基因序列相符，證明目的基因是插進(jìn)去了；但當(dāng)我用載體的通用引物測(cè)序時(shí)，就測(cè)不出來(lái)了。我也嘗試膠回收3000bp處的條帶鏈接T載體測(cè)序，但由于條帶很暗，膠回收后濃度很低，與T載體鏈接沒有成功。請(qǐng)各位大俠幫我分析下。不甚感激 |
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安群星
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3樓2016-12-01 11:50:13
winyuyuyu123
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-12-02 21:28:17
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-12-02 21:28:17
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污染了，挑菌時(shí)挑的不是單菌落，或者轉(zhuǎn)化時(shí)一個(gè)菌里邊轉(zhuǎn)進(jìn)去兩個(gè)質(zhì)粒。 出現(xiàn)你那種現(xiàn)象的原因： 通用引物會(huì)同時(shí)結(jié)合兩個(gè)載體，因此你擴(kuò)增會(huì)出現(xiàn)兩條帶，測(cè)序的話也會(huì)出現(xiàn)雜峰導(dǎo)致測(cè)不出來(lái)。 用你自己的引物只結(jié)合你的目標(biāo)載體，所以只能擴(kuò)增一條帶，測(cè)序也能正常測(cè)出。 解決方案： 1：現(xiàn)有菌液稀釋涂板或平板劃線，重新挑取單菌落搖菌培養(yǎng)。 2：若上述方法無(wú)法解決，可能是轉(zhuǎn)入多個(gè)質(zhì)粒，重做連接或吧之前做轉(zhuǎn)化的平板拿來(lái)重新挑單菌落檢測(cè)。 |
2樓2016-11-29 09:05:31
Alice 2016
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4樓2016-12-02 16:51:45
安群星
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5樓2016-12-26 14:40:43
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