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daifeng銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
以NADH為底物的酶的酶活測定 已有7人參與
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NADH在340nm處有吸光值，我現(xiàn)在利用的酶能氧化NADH成NAD+,所以在測定該酶的酶活時，是利用其在340nm處吸光值的減小來算的，另外我用的是752型分光光度計，在測定中有幾個疑問，想請教一下各位蟲友： 1、吸光值降低到負值，對酶活的測定影響大嗎？ 2、在測定中每次吸光值都是降到-0.097，而且在加入一個物質(zhì)時，酶活降低了將近50%，吸光值還是降到-0.097，這是什么原因呢？ 3、在后面的實驗中，又發(fā)現(xiàn)的是：空白對照后，在放入樣品前，發(fā)現(xiàn)其吸光值也是-0.097，那么對“2、”能給出的是什么結(jié)論呢？ 我在這先謝過各位蟲友啦^_^ |
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daifeng
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NADH為底物的酶活測定
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NOX酶活測定的反應(yīng)體系：反應(yīng)液總體積 3.2mL，含有0.1M的磷酸鉀緩沖濃液（pH7.0）、1mM的DTT、加入20mM NADH 25μl后于30℃保溫10min，再加入200μl酶液，以固定的頻率快速振蕩之后，通過紫外分光光度計于和340nm下連續(xù)跟蹤其吸光度的變化，連續(xù)測1 min，每隔6 s讀取數(shù)據(jù)。活力定義為：在上述條件下，每分鐘氧化1 μmol NADH所需的酶量為1個單位。其酶活力單位的計算公式如下： 酶活力單位（U/mL）＝（ Vt* ⊿A/⊿t) /（e*L* Vs ） (式2-1) Vt ：反應(yīng)液總體積，本實驗為3mL； Vs ：樣品體積，本實驗為0.20mL； e : 摩爾吸光系數(shù)，NADH在340 nm處的毫摩爾消光系數(shù)為6.22； L ：比色杯光徑 (cm)，本實驗中采用光徑1.0cm比色杯； ⊿A/⊿t：每分鐘吸光度變化值，實際根據(jù)初速度法取酶促反應(yīng)第一分鐘的⊿A，先后測3個平行樣取平均值； 比活力 (U/mg)：酶活 (U/mL) 與蛋白濃度 (mg/mL) 的比值。 由上所述，NOX活力單位（U/mL）=2.6×(⊿A/min)。 |
6樓2010-05-18 21:52:54
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吸光是正值說明你的樣品將光源的光吸收了一部分，要是為負值……是不是說你的樣品有自發(fā)關(guān)現(xiàn)象？所以我覺得你是不是應(yīng)該用你反應(yīng)完了的樣品，也就是NAD+（-0.097）的這個來調(diào)零，這樣你在測定的值就是正值了。 另外你的問題1 可能會有影響，在負值時線性關(guān)系可能會不好。 問題2 酶活降低，最終生成物濃度不變，這個說明你的酶量降低了一半，或者是有競爭性抑制劑在作用。問題3 這說明你的空白樣有吸收，用NAD+（-0.097）調(diào)零試試吧，這個對2好像沒什么影響吧。 個人觀點，不一定正確，等待高人指點 |
2樓2009-11-09 11:20:11
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