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北京石油化工學院2026年研究生招生接收調劑公告

star1987

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[交流] 【求助/交流】PCR問題求助

請教高手一個問題，我做PCR的時候用上海生工DNA Taq polymerase（紅蓋子的）（退火溫度梯度從45度到65度）都能P出來，而且條帶很亮，但是用LA Taq polymerase、Ex Taq polymerase和Prime Star都P不出來。這是什么原因？

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1樓 2010-12-21 15:28:59

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star1987

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amisking:這樣是不對的。 2010-12-21 20:32:41

自己沙發(fā)

2樓2010-12-21 16:01:23

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sxxuan

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star1987(金幣+1):謝謝 2010-12-21 16:21:28
rainwander(金幣+1):鼓勵積極參與~~~ 2010-12-21 19:07:20

不同的酶，條件有所不同吧。這種情況我也碰到過，當時是提高了退火溫度
普通taq，好像比較容易P出來，高保真的沒那么簡單。當時師兄這樣解釋給我聽

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3樓2010-12-21 16:11:55

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star1987

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Originally posted by sxxuan at 2010-12-21 16:11:55:
不同的酶，條件有所不同吧。這種情況我也碰到過，當時是提高了退火溫度
普通taq，好像比較容易P出來，高保真的沒那么簡單。當時師兄這樣解釋給我聽

不同的酶條件是不一樣，但我用高保真的酶也做了溫度梯度，還是P不出來。

4樓2010-12-21 16:21:09

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天使托

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其實有時就是這樣的情況，所以建議一直用一個公司的一種酶！

5樓2010-12-21 16:23:26

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yabxxh

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★
star1987(金幣+1): 2010-12-21 16:50:00
rainwander(金幣+1):鼓勵積極參與~~~ 2010-12-21 19:07:37

高保真的酶有著其特殊性，保真性能高了，PCR效率就會低，同樣的條件肯定不行。
我拿Prime Star來說吧，這個我用的多些。
普通的Taq，退火時間一般為30s，但是這個酶就比較特殊，退火時間10s，我擴增3k的片段照樣退火10s，這時候如果你用普通程序肯定做不出來。
建議好好研究一下各個酶的說明書，你會有很大收獲的，呵呵，好運

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6樓2010-12-21 16:28:56

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star1987

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Originally posted by yabxxh at 2010-12-21 16:28:56:
高保真的酶有著其特殊性，保真性能高了，PCR效率就會低，同樣的條件肯定不行。
我拿Prime Star來說吧，這個我用的多些。
普通的Taq，退火時間一般為30s，但是這個酶就比較特殊，退火時間10s，我擴增3k的片段照樣 ...

我都是按照每個酶的說明書做的，仍然謝謝你！

7樓2010-12-21 16:49:39

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star1987

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繼續(xù)求助高手來解答！

8樓2010-12-21 16:50:56

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Michael008

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做鑒定還是克��？如果從基因組P效率會很不穩(wěn)定，會不會你后來的模板有問題？

9樓2010-12-21 19:21:59

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star1987

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Originally posted by Michael008 at 2010-12-21 19:21:59:
做鑒定還是克�。咳绻麖幕蚪MP效率會很不穩(wěn)定，會不會你后來的模板有問題？

做克隆，應該不會的，模板是剛提的。

10樓2010-12-21 19:55:18

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Michael008

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star1987(金幣+1): 2010-12-21 20:25:14

模板是基因組嗎？
既然上次P出來過，有留底就好了，效率肯定能保證。
實在不行換PCR MIX試試，做克隆巨爽。

11樓2010-12-21 20:01:43

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超然渡陳之家

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我也遇到了同樣的問題，現(xiàn)在還在糾結。我是提RNA反轉錄成一鏈后作為模版擴基因。LA Taq很容易就擴出來了，但是有突變，改用高保真酶后做梯度一直不出帶。望高手指點��！

12樓2010-12-21 20:20:18

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Originally posted by Michael008 at 2010-12-21 20:01:43:
模板是基因組嗎？
既然上次P出來過，有留底就好了，效率肯定能保證。
實在不行換PCR MIX試試，做克隆巨爽。

模板是基因組。關鍵是高保真的酶P不出來。謝謝！

13樓2010-12-21 20:24:37

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rioarsenal

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Originally posted by star1987 at 2010-12-21 15:28:59:
請教高手一個問題，我做PCR的時候用上海生工DNA Taq polymerase（紅蓋子的）（退火溫度梯度從45度到65度）都能P出來，而且條帶很亮，但是用LA Taq polymerase、Ex Taq polymerase和Prime Star都P不出來。這是什么 ...

樓主做的是平行試驗么？用同樣的模板（同一個DNA樣品）做模板，不同的酶做的PCR么？最好上一個模板DNA的圖，大家研究研究

14樓2010-12-21 22:10:43

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star1987

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Originally posted by rioarsenal at 2010-12-21 22:10:43:

樓主做的是平行試驗么？用同樣的模板（同一個DNA樣品）做模板，不同的酶做的PCR么？最好上一個模板DNA的圖，大家研究研究

是平行試驗，模板序列如下：
ATGTGTTCTTCAATGACAATTAAATCGCTACAAGGTGATATTTTCTGGGGCCGGACCATGGATTACAACACCAGTTTCTTTCATGAATCACCAGTCGGCGGGGTTCCTGGTAAAATTGTCAGTTTGCCAGCAAACAAGGCATTACCAACACAAAGTGCCAAATGGACCACAAAGTATGCAGCGGTTGGCGTCGGTATTGATCAAAGTACGGCACTTTTCGACGGCGTCAATAGCGAAGGCTTGGCTGGCGACTTGCAGGTTTTGGTAGAGTGCAGCTGGGCGAGTGCGGATTCTTTGAAACAGCGTGGGCTGAAAGCTATTAAAGGCGAGGAGTTTGTGACCTTGGCCTTGACGACATGCAAAAATGTTGACGAAGTACGCGCTTTGGCGGGTGAGTATGGCCTGCTGGATGAACCTTATGAGTTTGGCGGCCAAGGGGTGAAAATCCCATTACATTACACATTTGTTGATCCATCAGGTAAGGGGATTGTTGTCGAACCAACCGATCACGGCGCCTTTAAGCTGTATGATAGCATCGGCGCCATGACGAATAGTCCTGAATACGGGTGGCATGAAACCAATTTGCGCAATTATGTCAGTCTGAATGACAATAACTATCCTAAGGGGTCCGAATTAGGCGACTACCATATTGAGCCGATTGAGTTAGGCACAGGCTACGGGATGTTCGGTTTGCCAGGCGATTACACATCACCATCGCGGTTTCTGCGGGCAATGTTTGTTTCGCGTAATCTTGATCCCTTCAATAGCAAAGACGGCATTCGCGTATTATACAATGCTTTCAAGACTGTCTTGATTCCGCAGGGGCTAGGTCGCGACCCACAACATCAGGTTTTAACGGATTACACGCAGTACTGGTCTGGCTATGATCTGACGAAAAAGACAATTTTCGTGCAAGATTCAGACACATTGACAATGACAACGAAAACACTTGATCCGACTATTACTGACGTCACTTATGAAGATTTGGCTAAAACTGAACAGTTCAATCAACTGTAG
上游引物：CGGGATCCGATGTGTTCTTCAATGACAATTAAATCGC
下游引物：CCCAAGCTTCTACAGTTGATTGAACTGTTCAGTTTTAGC

15樓2010-12-21 23:16:15

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rioarsenal

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★ ★
silicare(金幣+2):謝謝參與 2010-12-22 11:53:10
star1987(金幣+2):謝謝 2010-12-24 16:33:45

引用回帖:

Originally posted by star1987 at 2010-12-21 23:16:15:

是平行試驗，模板序列如下：
ATGTGTTCTTCAATGACAATTAAATCGCTACAAGGTGATATTTTCTGGGGCCGGACCATGGATTACAACACCAGTTTCTTTCATGAATCACCAGTCGGCGGGGTTCCTGGTAAAATTGTCAGTTTGCCAGCAAACAAGGCATTACCAACACAAAGTGCCAAATGGAC ...

剛才分析了一下這個序列的限制酶切點。有這樣一個辦法，樓主多提一些模板DNA（基因組），濃縮純化，然后用EcoRI或者HindIII消化模板DNA，也可兩種酶一起消化。目的是使模板變小，容易和引物結合。然后再做PCR。你試試看

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16樓2010-12-22 04:14:56

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zhfb.619

銅蟲 (初入文壇)

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我覺得４樓和５樓的說法，你最好選定一家公司的產品，而且好好研究下他們的說明書吧
相信總會找到問題答案的

17樓2010-12-22 09:45:21

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adslye

銀蟲 (正式寫手)

引用回帖:

Originally posted by 超然渡陳之家 at 2010-12-21 20:20:18:
我也遇到了同樣的問題，現(xiàn)在還在糾結。我是提RNA反轉錄成一鏈后作為模版擴基因。LA Taq很容易就擴出來了，但是有突變，改用高保真酶后做梯度一直不出帶。望高手指點啊！

LA就是高保真酶吧？突變其實很少的，你可以多試幾次�？傊�，我用LA構建載體很少很少極少有突變~~~

18樓2010-12-22 10:44:30

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adslye

銀蟲 (正式寫手)

★ ★ ★
silicare(金幣+3):很熱心的說~ 2010-12-22 11:53:29
star1987(金幣+2):非常感謝！ 2010-12-24 16:34:58

引用回帖:

Originally posted by star1987 at 2010-12-21 20:24:37:

模板是基因組。關鍵是高保真的酶P不出來。謝謝！

基因組最好要酶切~生工的酶的確效率很高，但有時候P出的那是啥啊！不敢恭維~~
我最近也是再做這個，恰好酶用的和你一樣，生工，TAKARA LA, 還有一個2Xmix的。

因為，我是基因組酶切后P的，所以都能P出來，我這的問題是2K以上的片段只能LA來P。

總之我的建議是：
1，確定你的基因組的純化做的OK，沒有酚什么殘留。
2，如果你還用基因組P，那就稀釋下做模板。
3，強烈建議酶切乙醇純化后再P。5,6個識別堿基的酶都可以~
4，確定生工P出來的東西是對的,可能就是假陽性，那個效率太高的東西不一定可靠。

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19樓2010-12-22 10:50:39

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wangy0908

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期待答案，遇到類似的問題了，正在愁呢

20樓2010-12-22 11:56:54

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wangy0908

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引用回帖:

Originally posted by adslye at 2010-12-22 10:50:39:

基因組最好要酶切~生工的酶的確效率很高，但有時候P出的那是啥��！不敢恭維~~
我最近也是再做這個，恰好酶用的和你一樣，生工，TAKARA LA, 還有一個2Xmix的。

因為，我是基因組酶切后P的，所以都能P出來， ...

我想問過初級的問題，酶切后P與酶切前P有什么區(qū)別的呢？？是模板接觸的程度有關還是什么的呢？另外，就是怎樣判斷你要P的區(qū)域是否有酶切位點？因為如果有酶切位點的話，也P不出來的啊。因為我做的是小麥的基因組，沒有被測序出來！

21樓2010-12-22 12:03:59

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rioarsenal

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Originally posted by wangy0908 at 2010-12-22 11:56:54:
期待答案，遇到類似的問題了，正在愁呢

請看我15樓的回復

22樓2010-12-22 14:25:50

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rioarsenal

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Originally posted by wangy0908 at 2010-12-22 12:03:59:

我想問過初級的問題，酶切后P與酶切前P有什么區(qū)別的呢？？是模板接觸的程度有關還是什么的呢？另外，就是怎樣判斷你要P的區(qū)域是否有酶切位點？因為如果有酶切位點的話，也P不出來的啊。因為我做的是小麥的基因 ...

請看我15樓的回復

23樓2010-12-22 14:26:36

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adslye

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Originally posted by wangy0908 at 2010-12-22 12:03:59:

我想問過初級的問題，酶切后P與酶切前P有什么區(qū)別的呢？？是模板接觸的程度有關還是什么的呢？另外，就是怎樣判斷你要P的區(qū)域是否有酶切位點？因為如果有酶切位點的話，也P不出來的啊。因為我做的是小麥的基因 ...

這個為啥基因組要酶切，我沒有資料給你。我也是被口傳口教授的。但可以想象下~~~空間上的關系~~不過，我偶爾偷懶用基因組直接P都能P出來。
另外至于酶切位點，除非你人品灰常差，否則應該沒問題。5個識別位點的切點平均4的5次方才出現(xiàn)一個~當然不排除個別序列的特殊情況。

我想問你下，你如何確定你的引物一定能P出條帶，既然你的目的條帶未知。

24樓2010-12-22 15:46:13

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最愛花詩雨

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單就酶來講也許很難搞懂，不過，既然你用上海生工DNA Taq polymerase能P出來，干嘛還要用其他的酶做呢？不同公司的酶和他們用的緩沖液等都或多或少有影響的

25樓2010-12-22 16:22:05

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star1987

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Originally posted by 最愛花詩雨 at 2010-12-22 16:22:05:
單就酶來講也許很難搞懂，不過，既然你用上海生工DNA Taq polymerase能P出來，干嘛還要用其他的酶做呢？不同公司的酶和他們用的緩沖液等都或多或少有影響的

上海生工DNA Taq polymerase不是高保真的酶，會引起突變的。

26樓2010-12-24 16:39:09

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zrr807

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27樓2011-11-06 21:23:21

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yimi6035

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高保真酶對條件要求很精確的，你如果不需要高保真，用tap就行啊

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28樓2011-11-07 11:22:27

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