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lliuzhi金蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】PCR求助 已有9人參與
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| 本人做的是普通PCR，剛開始做一直有目的產(chǎn)物，用的是生工的Taq酶，但是總會出現(xiàn)階段性沒有產(chǎn)物的情況，甚至都沒有非特異性產(chǎn)物和引物二聚體。之前懷疑是酶出了問題或者是模板降解了，但是經(jīng)檢測后模板沒有問題，也換了Taq、 TAKARA的Extaq、rtaq、生工的Pfu、可是仍舊沒有產(chǎn)物，后來偶然用同樣的東西又能P出來了，但是很不穩(wěn)定，過幾天又沒有了，請問高手是什么問題呢 |
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bioartist
木蟲 (正式寫手)
無菌草莓
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
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我認(rèn)為這問題的原因很多！ 1. 程序問題，請確定PCR儀器和設(shè)定的程序； I. 變性溫度足夠，對于基因組95度5min可以了，以菌液為模板的話，陰性菌可以延長5min，而陽性菌則可以延長到15min，不比擔(dān)心聚合酶變性； II. 退火溫度，第一次做的話，可以設(shè)定一個梯度，退火50-65度的溫度梯度，這個范圍30S時間對于引物都可以與模板結(jié)合； III. 延伸溫度，taq酶-1.0K/min，pfu酶-0.5K/min；各個公司的常規(guī)聚合酶的差別主要在保證性和延伸速度上，大多數(shù)都差別不大，沒別要頻繁更換聚合酶； 2. 引物問題 請再次分析下你的序列，是否和你要擴(kuò)增的基因匹配，并且預(yù)測下它們的Tm值，請不要低于55度，我個人常用的Tm值一般在58-62度之間； 3. 對于上面提到的加樣問題，在實(shí)驗(yàn)操作時，也要注意小心加樣，聚合酶太多的話，對反應(yīng)是有抑制作用的，根據(jù)每種聚合酶自己的說明書參考設(shè)計反應(yīng)體系即可。 以上是個人的一些經(jīng)驗(yàn)，樓主如果有什么問題，可以隨時和我聯(lián)系。祝你成功。 |
9樓2011-03-19 17:05:49
scelab
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小木蟲之有關(guān)部門負(fù)責(zé)人
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2樓2011-03-17 09:12:44
3樓2011-03-17 10:26:09
飄在海上的雪
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4樓2011-03-17 10:40:58
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