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[交流] 【求助/交流】緊急求助~~ 關(guān)于簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì) codehop 和genefisher 在線

求助關(guān)于簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)的問題，希望各位大蝦幫忙

本人做的是漆酶基因多樣性的東西，這是dnaman中比對(duì)的ncbi 下載的序列，有四個(gè)部分出現(xiàn)的保守區(qū)域還是不少，命名為1 2 3 4，放到codehop中之后要自己肉眼判斷保守區(qū)域的那一段然后手動(dòng)設(shè)計(jì)引物么？？學(xué)環(huán)境的好多東西實(shí)在是不懂~~ 希望大家不吝賜教啊~

[ Last edited by 憂游鳥 on 2011-3-31 at 20:28 ]

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1樓 2011-03-24 20:20:36

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1949stone(金幣+5): 鼓勵(lì) 2011-03-28 10:36:11

樓主可以依照codehop的引物設(shè)計(jì)理念，查找到相應(yīng)的保守區(qū)后，在保守區(qū)周圍設(shè)計(jì)引物。

找到你實(shí)驗(yàn)用的物種的密碼子偏好性表，然后對(duì)應(yīng)保守序列中的每個(gè)氨基酸殘基給出相應(yīng)的編碼三聯(lián)密碼子。對(duì)于保守區(qū)內(nèi)存在兩個(gè)或多個(gè)不同氨基酸殘基的位點(diǎn)，分別找出各氨基酸殘基的編碼密碼子，在這些位點(diǎn)上設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并堿基。一般說來，在進(jìn)化過程中，即便是氨基酸序列發(fā)生改變，也極有可能是因?yàn)槿幻艽a子的其中一位突變引起，所以其他兩位點(diǎn)均可能為保守。

引物近5’端序列盡量依照密碼子偏好性找到最大可能的編碼密碼子，盡可能不涉及簡(jiǎn)并堿基，并且5‘端要稍長(zhǎng)。3’端序列可以加入3、4個(gè)簡(jiǎn)并堿基，但是要注意的是，3’端最后兩位需按照密碼子偏好性找到編碼序列的前兩位，也就是說確定最后兩個(gè)堿基的正確性。

在數(shù)據(jù)庫中查找相應(yīng)比對(duì)序列時(shí)，盡量找親緣相近物種。

我們可以共同討論，codehop我是兩年前用過設(shè)計(jì)了不少簡(jiǎn)并引物，效果都不錯(cuò)。當(dāng)時(shí)查找資料很困難，用這個(gè)軟件設(shè)計(jì)引物的不多，而且都沒有詳細(xì)介紹。有時(shí)間可以考慮寫點(diǎn)這個(gè)軟件的應(yīng)用，以拋磚引玉。

樓主用好了也可以分享經(jīng)驗(yàn)。我都快忘光了，剛才拿出來試了一下，手生了很多。

樓上不知道是不是沒找到正確的軟件地址，我給你一個(gè)在線的，掌握了基本設(shè)計(jì)理念之后，上手還是蠻快的，個(gè)人感覺。
https://icodehop.cphi.washington.edu/i-codehop-context/Welcome

[ Last edited by csdyg on 2011-3-27 at 09:59 ]

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6樓2011-03-27 09:58:22

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1949stone(金幣+1): 呵呵不錯(cuò) 2011-03-28 10:35:47

我有一些這方面的經(jīng)驗(yàn)，codehop用了幾次，還不錯(cuò)，這會(huì)沒時(shí)間，等我下了班回去再給你說，或者你能詳細(xì)說你一下你的情況

[ Last edited by csdyg on 2011-3-26 at 19:09 ]

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2樓2011-03-26 01:13:29

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dhd997(金幣+3): 很熱心，在這里討論不方便嗎？ 2011-03-26 08:49:06
憂游鳥(金幣+20): 2011-03-26 11:06:43

在CODEHOP里粘貼進(jìn)你要比對(duì)的序列，生成比對(duì)結(jié)果之后，用引物設(shè)計(jì)，軟件會(huì)自動(dòng)在保守區(qū)序列上生成引物。

但是生成的引物效率并不一定很高，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，你最好人工檢查，然后根據(jù)codehop的基本設(shè)計(jì)原則自己設(shè)計(jì)引物

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3樓2011-03-26 05:11:41

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Originally posted by csdyg at 2011-03-26 05:11:41:
在CODEHOP里粘貼進(jìn)你要比對(duì)的序列，生成比對(duì)結(jié)果之后，用引物設(shè)計(jì)，軟件會(huì)自動(dòng)在保守區(qū)序列上生成引物。

但是生成的引物效率并不一定很高，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，你最好人工檢查，然后根據(jù)codehop的基本設(shè)計(jì)原則自己設(shè) ...

是的就是放進(jìn)去比對(duì)了之后又很多什么block unknown A B C D E 之類的了然后分值都是六十多最后還是要根據(jù)自己的保守區(qū)域來選取么需要反過來查找相應(yīng)的堿基序列來選擇密碼子的偏好性的堿基么

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4樓2011-03-26 11:19:22

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Originally posted by csdyg at 2011-03-26 01:13:29:
加我，我有一些這方面的經(jīng)驗(yàn)，codehop用了幾次，還不錯(cuò)，這會(huì)沒時(shí)間，等我下了班回去再給你說，或者你能詳細(xì)說你一下你的情況

你好！請(qǐng)問你如何用CODEHOP，我看了半天也沒看明白

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5樓2011-03-26 17:58:43

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謝謝，地址找到了，試了試，用著還不行，就想學(xué)學(xué)這個(gè)怎么用，我再摸索摸索

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7樓2011-03-27 20:44:03

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dhd997(金幣+5): 熱心 2011-03-29 08:42:11

可以去看看這個(gè)帖子，我剛發(fā)上，有關(guān)CODEHOP
http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3011161&fpage=1

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8樓2011-03-28 16:31:05

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Originally posted by csdyg at 2011-03-27 09:58:22:
樓主可以依照codehop的引物設(shè)計(jì)理念，查找到相應(yīng)的保守區(qū)后，在保守區(qū)周圍設(shè)計(jì)引物。

找到你實(shí)驗(yàn)用的物種的密碼子偏好性表，然后對(duì)應(yīng)保守序列中的每個(gè)氨基酸殘基給出相應(yīng)的編碼三聯(lián)密碼子。對(duì)于保守區(qū)內(nèi)存在兩 ...

您好~~ 我要擴(kuò)增的是一類功能基因，就是可能有不同的物種，有的是細(xì)菌，有的是放線菌，有的是子囊菌等，這樣就好像沒有辦法在那個(gè)網(wǎng)站里面找密碼子偏好表，只能一個(gè)一個(gè)去找么？

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9樓2011-03-28 20:48:04

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Originally posted by 憂游鳥 at 2011-03-28 20:48:04:
您好~~ 我要擴(kuò)增的是一類功能基因，就是可能有不同的物種，有的是細(xì)菌，有的是放線菌，有的是子囊菌等，這樣就好像沒有辦法在那個(gè)網(wǎng)站里面找密碼子偏好表，只能一個(gè)一個(gè)去找么？

你好，如果你確定每次擴(kuò)增中使用的模板來自單一物種，那最好是分別設(shè)計(jì)引物針對(duì)不同物種進(jìn)行擴(kuò)增。

如果你使用的模板是從多物種環(huán)境樣品中提取出來的，那就不好說了，比較有難度對(duì)照不同物種的密碼子偏好。不過樓主不用太擔(dān)心這一問題，因?yàn)榻^大部分情況下編碼同一氨基酸的密碼子前兩位是固定的，即使偏好性不同也只是在第3位上發(fā)生了改變。這樣的情況下，只在第三位上進(jìn)行簡(jiǎn)并，簡(jiǎn)并堿基盡量降低簡(jiǎn)并度，盡量少使用N\D\V\B等高簡(jiǎn)并度的設(shè)計(jì)，這需要你在核苷酸序列比對(duì)時(shí)多做工作，弄清進(jìn)化過程中同一氨基酸的編碼子的保守性。

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10樓2011-03-28 21:42:33

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不錯(cuò)，講的還挺詳細(xì)。
我個(gè)人經(jīng)驗(yàn)是，一個(gè)問題，在看了不同的帖子后，把一個(gè)問題的不同解釋都綜合起來再看的話，你那是可能就豁然開朗了！

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11樓2012-09-02 09:02:32

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1180704樓: Originally posted by csdyg at 2011-03-27 09:58:22
樓主可以依照codehop的引物設(shè)計(jì)理念，查找到相應(yīng)的保守區(qū)后，在保守區(qū)周圍設(shè)計(jì)引物。

找到你實(shí)驗(yàn)用的物種的密碼子偏好性表，然后對(duì)應(yīng)保守序列中的每個(gè)氨基酸殘基給出相應(yīng)的編碼三聯(lián)密碼子。對(duì)于保守區(qū)內(nèi)存在兩個(gè) ...

您好，我用codehop設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物在線顯示TM為60.8，可是合成以后，合成單子上變成了70.是不是codghop在線顯示的TM值不準(zhǔn)啊。還有TM在70左右的兼并引物是不是擴(kuò)增不出來目標(biāo)條帶��？

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12樓2012-09-05 20:39:17

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1364427樓: Originally posted by hraikeyan at 2012-09-05 20:39:17
您好，我用codehop設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物在線顯示TM為60.8，可是合成以后，合成單子上變成了70.是不是codghop在線顯示的TM值不準(zhǔn)啊。還有TM在70左右的兼并引物是不是擴(kuò)增不出來目標(biāo)條帶��？...

CODEHOP和公司合成后的TM都是預(yù)估的，特別是簡(jiǎn)并引物的TM。一般在使用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增的時(shí)候，TM并不適用，多數(shù)時(shí)候選擇較低的annealing temparature.

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13樓2012-09-06 16:21:13

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