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yuyan225金蟲 (小有名氣)
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[求助]
向RTPCR高手求助，關(guān)于RTPCR的空白對照問題
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| 各位蟲友大家好，我最近初做RTPCR，想請教一下高手是不是用于RTPCR的每對引物使用前都得進(jìn)行模板為水的空白對照實(shí)驗(yàn)，以確定后期熔解曲線的峰是不是出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增，望高手解答，謝謝！！ |
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2樓2011-06-17 18:21:21
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
yuyan225(金幣+7): 謝謝指教，收教了 2011-06-19 11:25:41
dhd997(金幣+5): good 2011-06-25 13:34:58
yuyan225(金幣+7): 謝謝指教，收教了 2011-06-19 11:25:41
dhd997(金幣+5): good 2011-06-25 13:34:58
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看空白對照是一個(gè)辦法，不過就算加利模板，在融解曲線里也是可以看出引物二聚體的峰的。就算大小差不多，引物二聚體的結(jié)合強(qiáng)度肯定不及PCR產(chǎn)物，Tm值要低些，跟產(chǎn)物相比，出現(xiàn)峰的位置肯定在溫度更低的地方。而且一般峰也相對更低（熒光信號相對弱）。 如果有產(chǎn)物，那擴(kuò)增曲線很早就會(huì)出現(xiàn)；如果是30個(gè)循環(huán)之后才出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，那可能就是引物二聚體了。 空白對照，應(yīng)該每次PCR里面都加入，可以檢查是否有污染及引物二聚體的情況。 樓主在3樓里擔(dān)心的片段大小與引物二聚體差不多這種情況，應(yīng)該很難出現(xiàn)吧。兩條引物加起來也就50bp不到，而熒光定量PCR的產(chǎn)物一般在150bp到300bp。所以，也可以在PCR之后跑個(gè)瓊脂糖凝膠電泳，一般能區(qū)分開PCR產(chǎn)物和引物二聚體。 |
4樓2011-06-18 22:13:58
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5樓2011-06-19 11:27:39
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6樓2011-06-19 12:06:44
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-06-25 13:35:22
dhd997(金幣+5, EPI+1): good 2011-06-25 13:35:22
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染料法的RT-PCR，要把擴(kuò)增曲線和溶解曲線結(jié)合起來來檢驗(yàn)擴(kuò)增的結(jié)果，主要是檢查擴(kuò)增的特異性，如果出現(xiàn)由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物，最好是另外做下電泳檢測更為保險(xiǎn)，實(shí)際上是一條擴(kuò)增曲線對應(yīng)一個(gè)PCR產(chǎn)物，而且應(yīng)該做幾個(gè)重復(fù)樣品，這時(shí)應(yīng)該多根據(jù)擴(kuò)增曲線去做判斷。沒有經(jīng)驗(yàn)的話就做個(gè)電泳。 |
10樓2011-06-25 00:48:08
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