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[交流] 問一下蛋白表達(dá)中出現(xiàn)的問題~

最近在做蛋白表達(dá)跑電泳的時(shí)候總在目的條帶附近出現(xiàn)一條比較拖尾的條帶，其他區(qū)域條帶都很正常，因?yàn)閹is標(biāo)簽，所以WB砸了一下，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后全菌、誘導(dǎo)后上清、沉淀均砸出條帶，誘導(dǎo)前可能是表達(dá)泄露了，因?yàn)樯锨逯刑�，過了下柱子基本沒東西，所以只能洗包涵體，現(xiàn)在想問下各位大牛箭頭所指那條有點(diǎn)拖尾的條帶是怎么回事，載體是pRSET-A，應(yīng)該就是我的目的蛋白，因?yàn)閾Q別的載體表達(dá)也在目的大小出現(xiàn)這樣的拖尾條帶，請(qǐng)問這影響我純化嗎，打抗體用？

圖中從第二張圖從左到右到第一張圖為誘導(dǎo)前全菌、誘導(dǎo)4h全菌、上清、沉淀，一共挑了7個(gè)單克隆。
謝謝各位啦~~

[ Last edited by snowice on 2011-7-18 at 00:40 ]

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1樓 2011-07-17 00:01:54

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lstt09nk(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2011-07-17 20:23:27

沒看出你的目標(biāo)蛋白在哪里
別跟我說是那個(gè)最下面的那條
那條是的可能性小，誘導(dǎo)前就有了
wb用的啥抗體，針對(duì)啥的
還有 photoshop學(xué)起來，起碼標(biāo)識(shí)要有
最起碼旋轉(zhuǎn)180度這個(gè)總要吧，畢竟從左到右習(xí)慣了

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2樓2011-07-17 07:53:23

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yang0071

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不好意思，his是哪個(gè)公司的，平常做其他his的話，那個(gè)帶位置有雜帶不？

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3樓2011-07-17 07:54:57

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引用回帖:

Originally posted by yang0071 at 2011-07-17 07:53:23:
沒看出你的目標(biāo)蛋白在哪里
別跟我說是那個(gè)最下面的那條
那條是的可能性小，誘導(dǎo)前就有了
wb用的啥抗體，針對(duì)啥的
還有 photoshop學(xué)起來，起碼標(biāo)識(shí)要有
最起碼旋轉(zhuǎn)180度這個(gè)總要吧，畢竟從左到右習(xí)慣了

嗯不好意思，昨晚發(fā)的太晚了沒來的及好好整就是倒數(shù)第二條marker附近那條比較拖得帶，我覺得可能就是那個(gè)，因?yàn)閾Q了GST的大標(biāo)簽也會(huì)在預(yù)測(cè)的大小附近出現(xiàn)拖得更厲害的條帶；誘導(dǎo)前有可能是表達(dá)泄露了吧，改天做個(gè)空質(zhì)粒對(duì)照看看好了；
您能告訴我為啥那條帶會(huì)拖嗎，因?yàn)槠渌麕Ф际钦５�，所以有點(diǎn)不明白，蛋白酶抑制劑啥的都加了的；
his 的抗體是sigma的，應(yīng)該沒問題，砸出條帶也很單一

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4樓2011-07-17 23:45:53

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引用回帖:

Originally posted by yang0071 at 2011-07-17 07:54:57:
不好意思，his是哪個(gè)公司的，平常做其他his的話，那個(gè)帶位置有雜帶不？

您好，圖片已改，請(qǐng)問下疑似目的條帶拖尾是怎么回事呢？多謝啦

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5樓2011-07-18 00:41:23

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最好有wb的圖作參考，更好判斷一些
目前可能性，1 表達(dá)量不錯(cuò)，蛋白很多，所以拖尾
2 產(chǎn)生剪切體，但是沒有wb不好判斷
不管哪種基本上表達(dá)出來了
至于純化，應(yīng)該可以。
打抗體，未知。存在于沉淀中，看你復(fù)性的情況了，打是可以打，就是出來是不是能用于wb還是ip的問題了

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6樓2011-07-18 08:33:53

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原核蛋白表達(dá)純化試驗(yàn)中，目的蛋白拖尾一般是有樣品量過大或溶解效果不佳引起的，一般不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響；包涵體蛋白復(fù)性中His標(biāo)簽很小且免疫原性很低，可以直接打抗體。

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7樓2015-02-12 13:40:45

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我去ヾ(｡｀Д′｡

，沒注意，陳年老貼啊

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8樓2015-02-12 13:43:56

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