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luge611新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR擴(kuò)到了基因上下游片段卻擴(kuò)不到全長，懇請高手指點(diǎn)幫助
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PCR擴(kuò)增未知基因全長（從真菌cDNA中擴(kuò)） 已知該基因的保守區(qū)，且通過PCR擴(kuò)到（假定設(shè)計(jì)的引物為F1，R1）。根據(jù)已報(bào)道同源基因設(shè)計(jì)的全長引物（假定為F2，R2），PCR得不到全長。嘗試了改變模板濃度、引物濃度，溫度梯度、touchdown PCR，均沒有擴(kuò)出。 最后，嘗試分別用F2和R1，F(xiàn)1和R2為引物（即兩對引物交叉使用，PCR條件基本合適），擴(kuò)到了基因的上下游片段，且上下游片段有500bp左右的重疊區(qū)。把兩個(gè)片段拼接后與同源基因比對，匹配度達(dá)到86%，根據(jù)拼接后的序列又重新設(shè)計(jì)了一對全長引物（F3，R3），結(jié)果PCR還是擴(kuò)不到。嘗試了改變PCR的各種條件，還是不行。 已經(jīng)分析，模板、酶、buffer都應(yīng)該沒問題（因?yàn)橛猛瑯訔l件兩個(gè)片段都擴(kuò)得到），引物用oligo分析也可以，退火溫度從低到高都試了，也做了touchdown可就是擴(kuò)不到。把兩個(gè)片段作為模板做PCR卻擴(kuò)得到。有可能是剛好擴(kuò)到了兩個(gè)基因的片段嗎？可比對了同屬真菌的同類基因沒有同源性這么高的。 不知道問題出在哪里，還請高手們給分析分析，支個(gè)招��！ |
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luge611
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