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造血干細胞銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
轉(zhuǎn)質(zhì)粒不成功,好幾次了,大家給分析一下問題會出在哪里
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| 目前在做質(zhì)粒構(gòu)建,問題是,載體酶切,片段酶切之后連接轉(zhuǎn)化涂板總是什么都不長,試過電轉(zhuǎn),DH4a轉(zhuǎn),都沒有成功,我之前沒怎么做過,實在不清楚問題出在哪里,求高手指教 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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blackrose8089
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4樓2011-08-23 20:42:49
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
造血干細胞(金幣+1): 片段是pcr擴出來的,當時特異性都不錯,是雙酶切不錯,根據(jù)你說的我估計是酶切沒切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18
造血干細胞(金幣+1): 片段是pcr擴出來的,當時特異性都不錯,是雙酶切不錯,根據(jù)你說的我估計是酶切沒切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18
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先轉(zhuǎn)個完整的載體質(zhì)�？纯撮L不長，不長的話就是感受態(tài)或者操作的問題，如果長就要從酶切方面考慮，載體和片段是不是都完全酶切了： （1）載體如果是雙酶切，建議你先用兩種酶分別單切，看看是否都能切開 （2）片段如果是從質(zhì)粒上切下來的，那應(yīng)該問題不大；如果是酶切的PCR產(chǎn)物，請確認保護堿基的數(shù)量是否足夠，一般每個位點有5個保護堿基比較保險 |
5樓2011-08-23 21:05:32
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 專家就是專家 2011-08-23 23:06:38
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 專家就是專家 2011-08-23 23:06:38
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很明顯主要原因應(yīng)該是連接的問題了 1：你的載體和基因酶切是否完全，尤其是載體，酶切出來的條帶要單一；還有就是載體和基因酶切完全后，要純化完全，不然很影響后期連接酶的效率的； 2：連接體系的設(shè)置，可以根據(jù)你載體和目的片段的大小，以及純化跑電泳出來的濃度進行定量，然后確定連接體系中載體添加多少，基因添加多少，這一步其實也很關(guān)鍵，如果體系中各反應(yīng)物不合適，那做一個克隆就比較難成功； 3：轉(zhuǎn)化，感受態(tài)細胞效率如何？篩選標記中如何（比如抗生素，抗生素抗性，濃度等等） 4：一般24h之內(nèi)只要長出來應(yīng)該問題不大，如果超過24h了基本就over了 一步一步檢查一下，看看哪一步問題比較大。。。然后再尋找解決對策！ 祝你好運！ |
6樓2011-08-23 21:44:05
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10樓2011-08-24 11:14:30
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