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藍(lán)綠精靈

銅蟲 (初入文壇)

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[交流] 載體連接pcr片段一直連不上

我用nde1和xba1雙酶切后的載體片段pLSB2（約4.5kb）分別與兩個(gè)pcr片段做連接，然后做轉(zhuǎn)化，整個(gè)實(shí)驗(yàn)全部都重新做了一遍，可一直連不上。請(qǐng)那位達(dá)人指點(diǎn)一下 ,衷心地表示謝謝！

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1樓 2011-09-25 10:50:08

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藍(lán)綠精靈

銅蟲 (初入文壇)

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謝謝了我說(shuō)說(shuō)最近的兩次實(shí)驗(yàn)情況吧，之前是轉(zhuǎn)化（無(wú)論是熱轉(zhuǎn)還是電轉(zhuǎn)）后平板上都未有菌落生長(zhǎng)。經(jīng)重新酶切質(zhì)粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr擴(kuò)增后酶切回收，前一次對(duì)照組（pLSB2）和實(shí)驗(yàn)組平板上都有菌落生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)劃線培養(yǎng)，然后液體培養(yǎng)提質(zhì)粒未發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒，確定為假陽(yáng)性。這一次一個(gè)實(shí)驗(yàn)組（連的2.6kb pcr片段）平板上有菌落生長(zhǎng)，只是不多（幾個(gè)的樣子），經(jīng)劃線培養(yǎng)，然后液體培養(yǎng)提質(zhì)粒單酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)多切除一條帶來(lái)，不知道是否有陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子存在。

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3樓2011-09-25 21:05:35

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清風(fēng)寨

銀蟲 (小有名氣)

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★ ★
lstt09nk(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2011-09-25 12:41:10

是你轉(zhuǎn)化后涂布的板子沒(méi)有長(zhǎng)呢還是挑出來(lái)的單菌落沒(méi)有目的基因呢你用的什么方法鑒定陽(yáng)性克隆的 PCR 還是直接抽質(zhì)粒鑒定可能原因很多具體情況說(shuō)出來(lái)可以幫你想想

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2樓2011-09-25 11:13:42

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清風(fēng)寨

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★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
adslye(金幣+2): 鼓勵(lì)交流~祝順利！ 2011-09-26 09:16:46
藍(lán)綠精靈(金幣+5): 非常感謝你即使的建議，我再試試 2011-09-27 09:29:21

首先連接時(shí)目的片段和酶切后質(zhì)粒的摩爾量最好是1：1左右（可通過(guò)回收后跑膠觀看亮度大致判斷一下）轉(zhuǎn)化時(shí)將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)后30min不要?jiǎng)铀?熱激90s后放置冰上2min使其冷卻這些都是必須的步驟且不能有錯(cuò) 涂布板子時(shí)像你這種基本不長(zhǎng)的可以不進(jìn)行涂布直接將恢復(fù)1h后的菌液到于平板上晃勻然后在超凈臺(tái)中開蓋吹干再進(jìn)行培養(yǎng) 還有就是你可以選用轉(zhuǎn)化效率高的超級(jí)感受態(tài) 你在鑒定時(shí)也不推薦你先抽質(zhì)粒鑒定可以做菌落PCR鑒定挑出陽(yáng)性克隆再挑

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4樓2011-09-26 09:07:34

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tianhuijuan

金蟲 (小有名氣)

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★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖

引用回帖:

3樓: Originally posted by 藍(lán)綠精靈 at 2011-09-25 21:05:35:
謝謝了我說(shuō)說(shuō)最近的兩次實(shí)驗(yàn)情況吧，之前是轉(zhuǎn)化（無(wú)論是熱轉(zhuǎn)還是電轉(zhuǎn)）后平板上都未有菌落生長(zhǎng)。經(jīng)重新酶切質(zhì)粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr擴(kuò)增后酶切回收，前一次對(duì)照組（pLSB2）和實(shí)驗(yàn)組平板 ...

樓上的意思是引物出問(wèn)題的可能性也很大？偶最近也是做這部分好長(zhǎng)時(shí)間了，長(zhǎng)不出菌落。。

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5樓2011-09-26 16:15:54

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