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[交流]
載體連接pcr片段一直連不上
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| 我用nde1和xba1雙酶切后的載體片段pLSB2（約4.5kb）分別與兩個pcr片段做連接，然后做轉(zhuǎn)化，整個實(shí)驗(yàn)全部都重新做了一遍，可一直連不上。請那位達(dá)人指點(diǎn)一下 ,衷心地表示謝謝！ |
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 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)問題 |
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
lstt09nk(金幣+3): 鼓勵交流，歡迎常來 2011-09-27 16:41:59
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lstt09nk(金幣+3): 鼓勵交流，歡迎常來 2011-09-27 16:41:59
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提供樓主兩種方法： 1.可以換一株相近的宿主菌試試，如果新?lián)Q的宿主菌中有陽性克隆，只能再換個質(zhì)粒做載體轉(zhuǎn)入到你的目的菌中。 2.PCR產(chǎn)物直接酶切，有時候可靠性不高。上次實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)與樓主相似情況，長出來的全是假陽性。將PCR產(chǎn)物通過ta克隆連接到T載后，挑陽性克隆，膠回收酶切片段后，再與目的質(zhì)粒連接就解決問題了。 祝好運(yùn)！ |
6樓2011-09-26 16:35:27
2樓2011-09-25 11:13:42
| 謝謝了 我說說最近的兩次實(shí)驗(yàn)情況吧，之前是轉(zhuǎn)化（無論是熱轉(zhuǎn)還是電轉(zhuǎn)）后平板上都未有菌落生長。經(jīng)重新酶切質(zhì)粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr擴(kuò)增后酶切回收，前一次對照組（pLSB2）和實(shí)驗(yàn)組平板上都有菌落生長，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)劃線培養(yǎng)，然后液體培養(yǎng)提質(zhì)粒未發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒，確定為假陽性。這一次一個實(shí)驗(yàn)組（連的2.6kb pcr片段）平板上有菌落生長，只是不多（幾個的樣子），經(jīng)劃線培養(yǎng)，然后液體培養(yǎng)提質(zhì)粒單酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)多切除一條帶來，不知道是否有陽性轉(zhuǎn)化子存在。 |
3樓2011-09-25 21:05:35
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
adslye(金幣+2): 鼓勵交流~祝順利！ 2011-09-26 09:16:46
藍(lán)綠精靈(金幣+5): 非常感謝你即使的建議，我再試試 2011-09-27 09:29:21
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
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藍(lán)綠精靈(金幣+5): 非常感謝你即使的建議，我再試試 2011-09-27 09:29:21
| 首先連接時目的片段和酶切后質(zhì)粒的摩爾量最好是1：1左右（可通過回收后跑膠 觀看亮度大致判斷一下 ） 轉(zhuǎn)化時將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)后30min不要動它 熱激90s后放置冰上2min使其冷卻 這些都是必須的步驟且不能有錯 涂布板子時像你這種基本不長的 可以不進(jìn)行涂布 直接將恢復(fù)1h后的菌液到于平板上晃勻 然后在超凈臺中開蓋吹干 再進(jìn)行培養(yǎng) 還有就是你可以選用轉(zhuǎn)化效率高的超級感受態(tài) 你在鑒定時也不推薦你先抽質(zhì)粒鑒定 可以做菌落PCR鑒定挑出陽性克隆再挑 |
4樓2011-09-26 09:07:34
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