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[交流]
載體連接pcr片段一直連不上
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| 我用nde1和xba1雙酶切后的載體片段pLSB2（約4.5kb）分別與兩個(gè)pcr片段做連接，然后做轉(zhuǎn)化，整個(gè)實(shí)驗(yàn)全部都重新做了一遍，可一直連不上。請(qǐng)那位達(dá)人指點(diǎn)一下 ,衷心地表示謝謝！ |
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 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)問(wèn)題 |
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9樓2011-09-27 09:15:37
清風(fēng)寨
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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2樓2011-09-25 11:13:42
| 謝謝了 我說(shuō)說(shuō)最近的兩次實(shí)驗(yàn)情況吧，之前是轉(zhuǎn)化（無(wú)論是熱轉(zhuǎn)還是電轉(zhuǎn)）后平板上都未有菌落生長(zhǎng)。經(jīng)重新酶切質(zhì)粒然后回收，重新找引物合成公司合成引物重新pcr擴(kuò)增后酶切回收，前一次對(duì)照組（pLSB2）和實(shí)驗(yàn)組平板上都有菌落生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)劃線培養(yǎng)，然后液體培養(yǎng)提質(zhì)粒未發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒，確定為假陽(yáng)性。這一次一個(gè)實(shí)驗(yàn)組（連的2.6kb pcr片段）平板上有菌落生長(zhǎng)，只是不多（幾個(gè)的樣子），經(jīng)劃線培養(yǎng)，然后液體培養(yǎng)提質(zhì)粒單酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)多切除一條帶來(lái)，不知道是否有陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子存在。 |
3樓2011-09-25 21:05:35
清風(fēng)寨
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
adslye(金幣+2): 鼓勵(lì)交流~祝順利！ 2011-09-26 09:16:46
藍(lán)綠精靈(金幣+5): 非常感謝你即使的建議，我再試試 2011-09-27 09:29:21
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藍(lán)綠精靈(金幣+5): 非常感謝你即使的建議，我再試試 2011-09-27 09:29:21
| 首先連接時(shí)目的片段和酶切后質(zhì)粒的摩爾量最好是1：1左右（可通過(guò)回收后跑膠 觀看亮度大致判斷一下 ） 轉(zhuǎn)化時(shí)將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)后30min不要?jiǎng)铀?熱激90s后放置冰上2min使其冷卻 這些都是必須的步驟且不能有錯(cuò) 涂布板子時(shí)像你這種基本不長(zhǎng)的 可以不進(jìn)行涂布 直接將恢復(fù)1h后的菌液到于平板上晃勻 然后在超凈臺(tái)中開(kāi)蓋吹干 再進(jìn)行培養(yǎng) 還有就是你可以選用轉(zhuǎn)化效率高的超級(jí)感受態(tài) 你在鑒定時(shí)也不推薦你先抽質(zhì)粒鑒定 可以做菌落PCR鑒定挑出陽(yáng)性克隆再挑 |
4樓2011-09-26 09:07:34
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