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Ag6501金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
枯草桿菌 電轉(zhuǎn)化 已有1人參與
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最近做試驗(yàn)又出狀況了： 需要往枯草桿菌WB800N里轉(zhuǎn)一個(gè)質(zhì)粒，大概9000bp多，但現(xiàn)在我做每次都能轉(zhuǎn)進(jìn)去，就是轉(zhuǎn)化效率很低，但我需要很高的轉(zhuǎn)化效率，所以再次求助各位高人了： 枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)方案（高滲透法）轉(zhuǎn)化 1）接種B . subtilis于3mlLB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng).。 2）取2.5ml過(guò)夜培養(yǎng)物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600=0.85~0.95. 3）將菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃離心收集菌體。 4）用50ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油），重新吹懸菌體，5000g，5min，4℃離心去上清，如此漂洗4次。 5）將洗滌后的菌體吹懸于1ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中，每EP管分裝60。 6）將60μl感受態(tài)細(xì)胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯（1mm）中，電擊一次。 電轉(zhuǎn)儀設(shè)置：2.0kv,1mm,電擊1次。（電擊結(jié)果：時(shí)間常數(shù)=4.5~5.0ms,如果時(shí)間常數(shù)<4.2 ,則需要增加電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基的漂洗次數(shù)或者提高感受態(tài)的稀釋倍數(shù)來(lái)獲得更高的轉(zhuǎn)化效率） 7）電擊完畢取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，復(fù)蘇3h后，涂板。37℃，過(guò)夜培養(yǎng)。 準(zhǔn)備 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2 200ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，10%甘油。 10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2個(gè)50ml離心管，滅菌。 |
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2樓2014-01-10 17:28:28
3樓2014-02-11 13:33:39
Ag6501
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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4樓2014-02-14 10:17:50
huangrui1988 
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5樓2014-02-14 21:21:45
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您好，關(guān)于2步法我查了一下有好多文獻(xiàn)，方法都略有差異。請(qǐng)問(wèn)您具體是用什么方法呢？ 這個(gè)是我查的一個(gè)貌似比較好用的方法。 1、劃線。 2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢搖床（100rpm）振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 3、次日取2ml轉(zhuǎn)接到18ml GMⅠ中，37℃快搖床（200rpm）培養(yǎng)3.5小時(shí)。 4、再取10ml轉(zhuǎn)接到90ml GMⅡ中，37℃慢搖床培養(yǎng)90分鐘，離心收集菌體。 5、用10ml原培養(yǎng)液上清液懸浮菌體，懸浮后的菌體即為感受態(tài)細(xì)胞，可以直接用于轉(zhuǎn)化；也可以加30%的滅菌甘油至終濃度10%，混勻后分裝到離心管中（0.5ml/Tube），隨即放到-70℃保存。 6、轉(zhuǎn)化時(shí)取出離心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入適量DNA（1ug/ml）。 7、于37℃緩慢振蕩（80rpm）培養(yǎng)，分別培養(yǎng)30min、45min、60min、75min、90min后，取100μl培養(yǎng)液涂抗性平板，再在37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日檢查轉(zhuǎn)化子。 【培養(yǎng)基配方】 1.10×最低鹽溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4.3H2O 18.34g），KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，檸檬酸鈉（Na3C6H5O7.2H2O）1g，MgSO4.7H2O 0.2g，在蒸餾水中依次溶解，加水至100ml。 2.L- trp溶液，2mg/ml，貯于棕色瓶?jī)?nèi)，113℃滅菌30min，用黑紙包裹。 3.GMⅠ溶液：1×最低鹽溶液95ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，2mg/ml L- trp 2.5ml（50ug/ml）。 4.GMⅡ溶液：1×最低鹽溶液97.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母汁0.04ml，0.5M MgCl2 0.5ml(2.5mM)，0.1M CaCl2 0.5ml(0.5mM)，2mg/ml L- trp 0.5ml（5ug/ml）。 |
6樓2014-02-27 22:01:01
huangrui1988
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7樓2014-02-27 22:02:13
8樓2014-02-27 22:06:58
huangrui1988
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9樓2014-02-27 22:09:52
10樓2014-02-27 22:11:51
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