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Ag6501金蟲 (正式寫手)
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[求助]
枯草桿菌 電轉(zhuǎn)化 已有1人參與
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最近做試驗(yàn)又出狀況了： 需要往枯草桿菌WB800N里轉(zhuǎn)一個(gè)質(zhì)粒，大概9000bp多，但現(xiàn)在我做每次都能轉(zhuǎn)進(jìn)去，就是轉(zhuǎn)化效率很低，但我需要很高的轉(zhuǎn)化效率，所以再次求助各位高人了： 枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)方案（高滲透法）轉(zhuǎn)化 1）接種B . subtilis于3mlLB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng).。 2）取2.5ml過夜培養(yǎng)物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600=0.85~0.95. 3）將菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4℃離心收集菌體。 4）用50ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%甘油），重新吹懸菌體，5000g，5min，4℃離心去上清，如此漂洗4次。 5）將洗滌后的菌體吹懸于1ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中，每EP管分裝60。 6）將60μl感受態(tài)細(xì)胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯（1mm）中，電擊一次。 電轉(zhuǎn)儀設(shè)置：2.0kv,1mm,電擊1次。（電擊結(jié)果：時(shí)間常數(shù)=4.5~5.0ms,如果時(shí)間常數(shù)<4.2 ,則需要增加電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基的漂洗次數(shù)或者提高感受態(tài)的稀釋倍數(shù)來獲得更高的轉(zhuǎn)化效率） 7）電擊完畢取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，復(fù)蘇3h后，涂板。37℃，過夜培養(yǎng)。 準(zhǔn)備 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2 200ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，10%甘油。 10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2個(gè)50ml離心管，滅菌。 |
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Ag6501
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