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syn1985木蟲 (正式寫手)
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[求助]
做過overlap PCR的蟲子過來看看
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我準備用in-frame deletion 做基因敲除 里面有一步是需要用overlap PCR擴增片段用以構(gòu)建敲除質(zhì)粒 我看PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS (A. Beliaev, S.B. Reed, D. Stanek, D. Saffarini, M. Romine)里面介紹的時候說overlap PCR的引物設(shè)計時需要加一個tag，就是擴增的兩個片段有一塊是互補的，上面指寫了要小于21bp，那這段序列應(yīng)該是自己在設(shè)計引物加上去的，可這段序列是自己隨便編一段，還是有設(shè)計依據(jù)的啊？困惑中......  PS 我不需要在這段里面加入酶切位點 謝謝各位蟲子 小女子在此謝過 |
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syn19859樓2011-11-22 16:43:18
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西瓜(MolEPI+1): Good！補上EPI！ 2011-11-22 18:01:43
| 前不久做了下，這個不是隨便加的，如果要將兩個片段融合起來，那么在設(shè)計前面片段的反向引物的時候在5'端加上后面片段開始的堿基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就是說中間兩個引物是反向互補的，40nt左右，也就是重疊PCR中重疊的部分 |
2樓2011-11-21 18:30:38
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