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[求助]
熒光定量PCR的擴增曲線很奇怪，什么原因 已有2人參與
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第一次做熒光定量PCR，得到的擴增曲線很奇怪，不知道是什么原因，求指教！還有要是CT值過高是不是應(yīng)該增加模板的濃度��？ |
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7樓2014-07-10 22:22:38
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+4, 很熱心很耐心！個人也認為是無擴增…… 2012-03-28 11:10:23
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西瓜: 金幣+4, 很熱心很耐心！個人也認為是無擴增…… 2012-03-28 11:10:23
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嗯........................ 我是這樣認為的： 你看到那個紅色的線了嗎，那應(yīng)該是闕值線，如果你沒有手動調(diào)整過的話，在闕值線以下的都是背景雜信號，忽上忽下的很正常，后邊沒有在一定范圍內(nèi)起峰，說明是無產(chǎn)物擴增的，如果你用的SYBR Green I 法，也同時會有溶解曲線分析吧，若那里邊也是沒有很尖銳的峰出現(xiàn)（我這里是籠統(tǒng)的說法），只能說明你這個擴增是沒有產(chǎn)物出現(xiàn)的。而且你圖不是很清晰，看不清楚縱軸是什么標示。 問題很多，不能在這一概而就的說明 希望有所幫助，如果有說錯地方，請各位高手指點  |
2樓2012-03-27 20:27:47
3樓2012-03-28 09:05:33
atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 最近很犀利啊~Real-time產(chǎn)物跑膠是可行的，我自己也做過，嘿嘿~ 2012-03-28 11:12:13
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 最近很犀利啊~Real-time產(chǎn)物跑膠是可行的，我自己也做過，嘿嘿~ 2012-03-28 11:12:13
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嗯..... 個人看法： 為什么大家把溶解曲線看的這么重要呢，我覺得本末倒置了，若是你的擴增曲線都沒有再一定范圍內(nèi)起峰的話，溶解曲線即使是單一峰又有什么用呢？況且你還要看峰的尖銳程度，峰的高低。我就說這么幾個例子吧： 1. 以前用某樂的96-microplate，總在77~80度左右有單一小側(cè)峰，考慮引物問題等眾多事情后仍舊無解，最后同樣實驗條件使用某A的8-Strip tube，前邊的雜峰消除。 2. 做過NTC，發(fā)現(xiàn)三重復(fù)都在38Ct時左右起峰，溶解曲線很單一，與內(nèi)參同溫度，但峰最高值是其一半左右，至今仍無解。 所以你只能有擴增才能用溶解來證明是不是擴增正確，而不能沒擴增卻用溶解來說明有擴增，如果實在不放心，那就那擴增產(chǎn)物跑膠，理論可行，但我沒有試過。 那個闕值線的問題，你可以參照偶回答的帖子 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=4305783&authorid=1099992 祝實驗順利 如有說錯，請高手指點 |
4樓2012-03-28 09:47:03
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