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oceanworld木蟲 (小有名氣)
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[求助]
引物加保護堿基
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各位大俠請問一下，我要做雙酶切，設計了一對引物加了保護堿基和酶切位點，但是卻擴增不出正確的目的片段，用沒加保護堿基和酶切位點的引物能夠擴增出正確的目的片段，請問這是怎么回事呢？下面是我設計的加了保護堿基和酶切位點的引物！謝謝各位了！ 5’ CCGCTCGAGACTTTTGGCCAGCTGCCTCT 3’ xhoI 5’ CCCAAGCTTATCATCAACAGGGAACTGTTG 3’ HindIII |
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ilaveu
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oceanworld
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3樓2012-03-31 08:28:49
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【答案】應助回帖
★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
oceanworld: 金幣+2, ★有幫助 2012-04-02 15:37:40
感謝參與，應助指數(shù) +1
oceanworld: 金幣+2, ★有幫助 2012-04-02 15:37:40
| 你的問題以我的經(jīng)驗絕對是做的問題，不會因為加了酶切位點和保護堿基而擴增有問題，當然你必須明白一下幾個問題：1 模板是質粒還是基因組，如果是基因組的話有可能會出現(xiàn)擴增有誤的現(xiàn)象，但是幾率也很小。2 做一個梯度，篩選一個退火溫度，不過據(jù)我經(jīng)驗，加了酶切位點和保護堿基的引物退火溫度和不加這兩個的原始引物退火溫度相同即可。3 注意使用好的PCR相關試劑，別用便宜不穩(wěn)定的產(chǎn)品，這也很能影響擴增效果。4 注意PCR中的延伸時間設置，TAQ酶和高保真酶的延伸時間是不一樣的，根據(jù)自己目的片段長度來設置。 |
6樓2012-04-01 09:14:08
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7樓2012-04-01 11:07:42
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8樓2013-04-01 22:04:09
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