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oceanworld木蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
引物加保護(hù)堿基
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各位大俠請(qǐng)問(wèn)一下，我要做雙酶切，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物加了保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)，但是卻擴(kuò)增不出正確的目的片段，用沒(méi)加保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)的引物能夠擴(kuò)增出正確的目的片段，請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事呢？下面是我設(shè)計(jì)的加了保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)的引物！謝謝各位了！ 5’ CCGCTCGAGACTTTTGGCCAGCTGCCTCT 3’ xhoI 5’ CCCAAGCTTATCATCAACAGGGAACTGTTG 3’ HindIII |
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2樓2012-03-30 19:16:35
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3樓2012-03-31 08:28:49
4樓2012-03-31 19:47:58
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
oceanworld: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-04-01 08:13:24
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解決方案1：采用兩步法PCR，前5個(gè)循環(huán)退火溫度采用不加酶切位點(diǎn)時(shí)的引物退火溫度（Ta opt），待擴(kuò)增出部分PCR產(chǎn)物片段后，后25個(gè)循環(huán)再用加酶切位點(diǎn)后引物的退火溫度。 解決方案2：先用不加酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)出產(chǎn)物，將產(chǎn)物至少稀釋100倍，做第2輪PCR的模板，第2輪PCR用帶酶切位點(diǎn)的引物對(duì)擴(kuò)增。 |
5樓2012-04-01 01:46:34
huguangdong
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
oceanworld: 金幣+2, ★有幫助 2012-04-02 15:37:40
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
oceanworld: 金幣+2, ★有幫助 2012-04-02 15:37:40
| 你的問(wèn)題以我的經(jīng)驗(yàn)絕對(duì)是做的問(wèn)題，不會(huì)因?yàn)榧恿嗣盖形稽c(diǎn)和保護(hù)堿基而擴(kuò)增有問(wèn)題，當(dāng)然你必須明白一下幾個(gè)問(wèn)題：1 模板是質(zhì)粒還是基因組，如果是基因組的話有可能會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增有誤的現(xiàn)象，但是幾率也很小。2 做一個(gè)梯度，篩選一個(gè)退火溫度，不過(guò)據(jù)我經(jīng)驗(yàn)，加了酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的引物退火溫度和不加這兩個(gè)的原始引物退火溫度相同即可。3 注意使用好的PCR相關(guān)試劑，別用便宜不穩(wěn)定的產(chǎn)品，這也很能影響擴(kuò)增效果。4 注意PCR中的延伸時(shí)間設(shè)置，TAQ酶和高保真酶的延伸時(shí)間是不一樣的，根據(jù)自己目的片段長(zhǎng)度來(lái)設(shè)置。 |
6樓2012-04-01 09:14:08
分子菜鳥(niǎo)
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7樓2012-04-01 11:07:42
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8樓2013-04-01 22:04:09
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