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oceanworld木蟲 (小有名氣)
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[求助]
引物加保護(hù)堿基
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各位大俠請(qǐng)問一下，我要做雙酶切，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物加了保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)，但是卻擴(kuò)增不出正確的目的片段，用沒加保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)的引物能夠擴(kuò)增出正確的目的片段，請(qǐng)問這是怎么回事呢？下面是我設(shè)計(jì)的加了保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)的引物！謝謝各位了！ 5’ CCGCTCGAGACTTTTGGCCAGCTGCCTCT 3’ xhoI 5’ CCCAAGCTTATCATCAACAGGGAACTGTTG 3’ HindIII |
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oceanworld
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3樓2012-03-31 08:28:49
ilaveu
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2樓2012-03-30 19:16:35
4樓2012-03-31 19:47:58
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
oceanworld: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-04-01 08:13:24
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解決方案1：采用兩步法PCR，前5個(gè)循環(huán)退火溫度采用不加酶切位點(diǎn)時(shí)的引物退火溫度（Ta opt），待擴(kuò)增出部分PCR產(chǎn)物片段后，后25個(gè)循環(huán)再用加酶切位點(diǎn)后引物的退火溫度。 解決方案2：先用不加酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)出產(chǎn)物，將產(chǎn)物至少稀釋100倍，做第2輪PCR的模板，第2輪PCR用帶酶切位點(diǎn)的引物對(duì)擴(kuò)增。 |
5樓2012-04-01 01:46:34
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