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xiazhiwuxie銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
大片段連接問題
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實驗室得到一個片段為2300bp左右的DNA序列，但是連接了半個月都沒有連上，連接體系是：19T 0.5ul 目的條帶 5ul solution I 5ul 過夜4度，16度連接3h 也做過16度連接兩夜 做過4度 期間確定目的條帶回收正確，連接體系也用了最新的，感受態(tài)是買的，在這個條帶的靠近3‘端約200bp是已知的，根據(jù)這個片段設(shè)計引物，擴增約為140bp。 得到的結(jié)果：1.不長菌 2.長菌，但是擴增無條帶 3.長菌，擴增出140bp,但是測序后，結(jié)果告知插入片段只有200bp,且這200bp片段就是已知部分，抽了質(zhì)粒后得知條帶大約就是比2000bp的大點。 我快瘋了，折騰了半個月，序列還沒得到，求高人指導(dǎo)！ |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 |
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5樓2012-04-15 16:56:45
dingfang0707
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 1570.1
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- 專業(yè): 細胞增殖、生長與分化
2樓2012-04-14 20:20:10
ghs25372216
禁蟲 (正式寫手)
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+5, ★有幫助, 我昨天想用T4連接酶連著，但是實驗室沒人做過，今天試試 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金幣+3, 恩，可以試下 2012-04-16 13:54:47
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3樓2012-04-15 09:46:42
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+2, ★有幫助, PCR回收后條帶清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵正解解答問題 2012-04-16 13:55:10
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xiazhiwuxie: 金幣+2, ★有幫助, PCR回收后條帶清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵正解解答問題 2012-04-16 13:55:10
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1.連接體系為10uL，目的DNA片段應(yīng)為4.5uL,一般試劑盒都可用，連接溫度是不關(guān)鍵因素，時間過夜即可。 2.一定要保證PCR要達到一定濃度和純度才可以，這一點至關(guān)重要。 3.另外，樓主說的300bp引物是菌液PCR檢測引物嗎？最好用一個載體引物，一個片段上的引物，假陽性會降低，而且最好把全長擴出來。 4.若果菌液ＰＣＲ擴出來了就不用提質(zhì)粒了酶切了，可以直接測序。 |
4樓2012-04-15 12:16:44
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