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xiazhiwuxie銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
大片段連接問(wèn)題
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實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)片段為2300bp左右的DNA序列，但是連接了半個(gè)月都沒(méi)有連上，連接體系是：19T 0.5ul 目的條帶 5ul solution I 5ul 過(guò)夜4度，16度連接3h 也做過(guò)16度連接兩夜 做過(guò)4度 期間確定目的條帶回收正確，連接體系也用了最新的，感受態(tài)是買的，在這個(gè)條帶的靠近3‘端約200bp是已知的，根據(jù)這個(gè)片段設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增約為140bp。 得到的結(jié)果：1.不長(zhǎng)菌 2.長(zhǎng)菌，但是擴(kuò)增無(wú)條帶 3.長(zhǎng)菌，擴(kuò)增出140bp,但是測(cè)序后，結(jié)果告知插入片段只有200bp,且這200bp片段就是已知部分，抽了質(zhì)粒后得知條帶大約就是比2000bp的大點(diǎn)。 我快瘋了，折騰了半個(gè)月，序列還沒(méi)得到，求高人指導(dǎo)！ |
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ghs25372216
禁蟲(chóng) (正式寫手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+5, ★有幫助, 我昨天想用T4連接酶連著，但是實(shí)驗(yàn)室沒(méi)人做過(guò)，今天試試 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金幣+3, 恩，可以試下 2012-04-16 13:54:47
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+5, ★有幫助, 我昨天想用T4連接酶連著，但是實(shí)驗(yàn)室沒(méi)人做過(guò)，今天試試 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金幣+3, 恩，可以試下 2012-04-16 13:54:47
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3樓2012-04-15 09:46:42
16樓2012-04-16 19:16:50
dingfang0707
金蟲(chóng) (正式寫手)
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2樓2012-04-14 20:20:10
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+2, ★有幫助, PCR回收后條帶清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)正解解答問(wèn)題 2012-04-16 13:55:10
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)正解解答問(wèn)題 2012-04-16 13:55:10
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1.連接體系為10uL，目的DNA片段應(yīng)為4.5uL,一般試劑盒都可用，連接溫度是不關(guān)鍵因素，時(shí)間過(guò)夜即可。 2.一定要保證PCR要達(dá)到一定濃度和純度才可以，這一點(diǎn)至關(guān)重要。 3.另外，樓主說(shuō)的300bp引物是菌液PCR檢測(cè)引物嗎？最好用一個(gè)載體引物，一個(gè)片段上的引物，假陽(yáng)性會(huì)降低，而且最好把全長(zhǎng)擴(kuò)出來(lái)。 4.若果菌液ＰＣＲ擴(kuò)出來(lái)了就不用提質(zhì)粒了酶切了，可以直接測(cè)序。 |
4樓2012-04-15 12:16:44
5樓2012-04-15 16:56:45
天使托
專家顧問(wèn) (職業(yè)作家)
T.Shen
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6樓2012-04-15 21:41:25
7樓2012-04-15 23:25:34
8樓2012-04-16 09:13:10
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+2, 看來(lái)你們的酶不錯(cuò)呀~ 2012-04-16 21:35:44
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+2, 看來(lái)你們的酶不錯(cuò)呀~ 2012-04-16 21:35:44
| 其實(shí)2k不算什么大片段的，我們單個(gè)基因就有2k多，幾個(gè)基因下來(lái)更長(zhǎng)。我們一般的體系是10ul，酶0.5，buffer 1，基因加載體8.5，至于兩者比例要看電泳條帶，但載體不超過(guò)3ul。連接十分鐘到半個(gè)小時(shí)（說(shuō)明書是十分鐘，但我們一般會(huì)延長(zhǎng)一點(diǎn)，除非時(shí)間來(lái)不及）立馬做轉(zhuǎn)化（10ul/100ul）。 |
9樓2012-04-16 10:27:07
YZQ_XM
銅蟲(chóng) (初入文壇)
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10樓2012-04-16 10:51:02
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