 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3301 | 回復(fù): 20 | ||||
xiazhiwuxie銀蟲 (小有名氣)
|
[求助]
大片段連接問題
|
|||
|
實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)片段為2300bp左右的DNA序列，但是連接了半個(gè)月都沒有連上，連接體系是：19T 0.5ul 目的條帶 5ul solution I 5ul 過夜4度，16度連接3h 也做過16度連接兩夜 做過4度 期間確定目的條帶回收正確，連接體系也用了最新的，感受態(tài)是買的，在這個(gè)條帶的靠近3‘端約200bp是已知的，根據(jù)這個(gè)片段設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增約為140bp。 得到的結(jié)果：1.不長菌 2.長菌，但是擴(kuò)增無條帶 3.長菌，擴(kuò)增出140bp,但是測序后，結(jié)果告知插入片段只有200bp,且這200bp片段就是已知部分，抽了質(zhì)粒后得知條帶大約就是比2000bp的大點(diǎn)。 我快瘋了，折騰了半個(gè)月，序列還沒得到，求高人指導(dǎo)！ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有166人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 構(gòu)建pBI121表達(dá)載體，目的基因與載體連接不上
已經(jīng)有54人回復(fù)
- BAC文庫連接轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有22人回復(fù)
- PCR ， 雙酶切，連接問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 連接體系的確定
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 載體連接
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 為什么我做的酶切連接總是不長斑呢？
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 【求助/交流】連接幾次，仍然不見菌落出現(xiàn)
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 【求助/交流】pMD-18T載體連接出現(xiàn)了問題，請(qǐng)各位高手指點(diǎn)�。。�
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】超大片段連接問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】4kb片段的連接
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】大片段連接轉(zhuǎn)化成功與否問題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】長片段的連接轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于PCR克隆片段連接問題
已經(jīng)有4人回復(fù)
ghs25372216
禁蟲 (正式寫手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+5, ★有幫助, 我昨天想用T4連接酶連著，但是實(shí)驗(yàn)室沒人做過，今天試試 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金幣+3, 恩，可以試下 2012-04-16 13:54:47
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+5, ★有幫助, 我昨天想用T4連接酶連著，但是實(shí)驗(yàn)室沒人做過，今天試試 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金幣+3, 恩，可以試下 2012-04-16 13:54:47
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
3樓2012-04-15 09:46:42
16樓2012-04-16 19:16:50
dingfang0707
金蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 1570.1
- 散金: 499
- 紅花: 2
- 帖子: 507
- 在線: 208.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 1177271
- 注冊: 2010-12-25
- 性別: MM
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
2樓2012-04-14 20:20:10
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+2, ★有幫助, PCR回收后條帶清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)正解解答問題 2012-04-16 13:55:10
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiazhiwuxie: 金幣+2, ★有幫助, PCR回收后條帶清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)正解解答問題 2012-04-16 13:55:10
|
1.連接體系為10uL，目的DNA片段應(yīng)為4.5uL,一般試劑盒都可用，連接溫度是不關(guān)鍵因素，時(shí)間過夜即可。 2.一定要保證PCR要達(dá)到一定濃度和純度才可以，這一點(diǎn)至關(guān)重要。 3.另外，樓主說的300bp引物是菌液PCR檢測引物嗎？最好用一個(gè)載體引物，一個(gè)片段上的引物，假陽性會(huì)降低，而且最好把全長擴(kuò)出來。 4.若果菌液ＰＣＲ擴(kuò)出來了就不用提質(zhì)粒了酶切了，可以直接測序。 |
4樓2012-04-15 12:16:44
5樓2012-04-15 16:56:45
天使托
專家顧問 (職業(yè)作家)
T.Shen
-
專家經(jīng)驗(yàn): +57 - MolEPI: 106
- 應(yīng)助: 95 (初中生)
- 貴賓: 0.263
- 金幣: 16332.8
- 散金: 593
- 紅花: 74
- 沙發(fā): 9
- 帖子: 3652
- 在線: 289小時(shí)
- 蟲號(hào): 441757
- 注冊: 2007-10-27
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
- 管轄: 微生物
6樓2012-04-15 21:41:25
7樓2012-04-15 23:25:34
8樓2012-04-16 09:13:10
9樓2012-04-16 10:27:07
YZQ_XM
銅蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 26 (小學(xué)生)
- 金幣: 123.2
- 帖子: 44
- 在線: 20.7小時(shí)
- 蟲號(hào): 1757855
- 注冊: 2012-04-16
- 專業(yè): 遺傳學(xué)研究新技術(shù)與方法
10樓2012-04-16 10:51:02
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 xiazhiwuxie 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 267一志愿南京工業(yè)大學(xué)0817化工求調(diào)劑 +7 | SUICHILD 2026-03-12 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 總分331 +3 | ZY-05 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +11 | zjl的號(hào) 2026-03-16 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 277調(diào)劑 +5 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿蘇州大學(xué)材料工程（085601）專碩有科研經(jīng)歷三項(xiàng)國獎(jiǎng)兩個(gè)實(shí)用型專利一項(xiàng)省級(jí)立項(xiàng) +6 | 大火山小火山 2026-03-16 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +6 | 孔志浩 2026-03-12 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 302求調(diào)劑 +4 | 小賈同學(xué)123 2026-03-15 | 8/400 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)]
今年的國基金是打分制嗎？
 50+3
|
zhanghaozhu 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +5 | 素年祭語 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070300化學(xué)學(xué)碩求調(diào)劑 +6 | 太想進(jìn)步了0608 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考博] 東華理工大學(xué)化材專業(yè)26屆碩士博士申請(qǐng) +6 | zlingli 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0856專碩279求調(diào)劑 +5 | 加油加油！? 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +4 | 這么名字咋樣 2026-03-14 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +4 | 威化餅07 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +3 | 5201314Lsy！ 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料工程調(diào)劑 +9 | 咪咪空空 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 求材料調(diào)劑 085600英一數(shù)二總分302 前三科235 精通機(jī)器學(xué)習(xí) 一志愿哈工大 +4 | 林yaxin 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +4 | 芬達(dá)46 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 程雨杭 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 26讀博 +4 | Rui135246 2026-03-12 | 10/500 |
|