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zhoujiang09新蟲 (初入文壇)
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[交流]
熒光定量PCR的實驗思路（求助） 已有1人參與
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| 各位師兄師姐，我想請教一下熒光定量PCR的實驗思路，我之前把RNA提了出來，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA了，并做了普通PCR。現(xiàn)在我要開始做熒光定量PCR了，可是我不怎么會，我做的是相對定量（2-deltadelta Ct 法），請師兄師姐們幫幫我。我聽有些人說先要拿模板（cDNA）上機摸索退火溫度，再拿ct值最小的那個作為標(biāo)準(zhǔn)品，適當(dāng)?shù)谋稊?shù)稀釋成5個梯度，再做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后上樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，是這樣嗎？ |
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孫啟亮
金蟲 (著名寫手)
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小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 專家考核, 專業(yè)解答， 2012-04-16 13:39:00
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小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 專家考核, 專業(yè)解答， 2012-04-16 13:39:00
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你首先得買熒光，不要買多，因為現(xiàn)在你還不知道哪個公司的熒光更適合你的目的基因。具體的結(jié)果還得等你做擴增效率的時候才知道。建議直接做熒光，不做普通的，這樣節(jié)省時間同時也不會比先做普通PCR節(jié)省多少錢。 其次，摸索實驗條件一般都是摸索退火溫度，你可以根據(jù)自己設(shè)計的引物大致確定你的退火溫度在什么范圍，然后做熒光，跑膠，根據(jù)擴增曲線與跑膠條帶灰度值等綜合指標(biāo)選定一個合適的退火溫度。 再次，合適的Ct值范圍應(yīng)該是18-30，最好在23-24左右。但是有時候15以上，32以下也是可以接受的，這主要和你的目的基因有關(guān)。一般會出現(xiàn)的情況是Ct值太高，但如果你的目的基因拷貝數(shù)太低，那Ct值肯定高。 最后，關(guān)于擴增效率，擴增效率的制作不需要對照，你的目的就是做引物的擴增效率，看這個引物能不能被你所用。目的基因和內(nèi)參都得做，擴增效率直接影響到你的定量計算公式是否適用。只有在擴增效率在90%-105%的時候，才能用你說的那種方法。但有時候120%以下的擴增效率也可以接受。擴增效率的制作是通過倍比稀釋法，做六個梯度。 祝樓主實驗順利 |
2樓2012-04-16 08:33:01
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