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[交流]
關于變性條件下his-tag重組融合蛋白不結合鎳柱以及部分結合鎳柱情況
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最近做包涵體比較多，總體還好，但是遇到二個很棘手的問題： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一點都不結合鎳柱 2：有些蛋白部分掛鎳柱，FT總是很多。 請各位在交流之前先看好下面的條件： 1，我們一次處理12個蛋白，有的是ok的，有的不掛，或者部分掛，因此排除什么pH，buffer，離子強度的問題，因為如果是這個問題，那就是都不掛，或者都部分掛。 當然大家不用說是蛋白需要不同buffer，如果你要 說這個因素，那我請問你，你每次做鎳柱親和會用不同buffer嗎，有區(qū)別嗎？ 何況不管invotrogen還是novagen的標準protocol也是一個buffer，沒搞得花里胡哨的。這個版里面提這個問題的很多，很多都是更換過buffer，絕對是無效的，我們自己也做過這方面的試驗，沒結果，因此buffer不是問題，我們是變性純化。 2，我們具體就是在洗滌包涵體后，用8M尿素溶解，同時加入10mM 2-me，在這里強調下，包涵體洗滌不是大問題，溶解不是大問題，我們基本都能溶解出來，電泳分析的結果。 3，我們binding buffer沒有加任何咪唑，沒有edta，剛開始加入的b-me在上柱子前我們處理了，不會對鎳柱用影像，同時his-tag在N端，因此排除提前終止的可能。 4，我們實驗室純化了快1000個蛋白了，因此低級的錯誤在我們這里是不會的。我們每次試驗時重復的，因此不用懷疑我們手法問題，要不然不會做這么多。 科研有不確定因素，但是不是毫無規(guī)律可循，因此請大家結合自身經驗來討論這個問題，而不是東一鋤頭，西一板斧的瞎提。請看清楚我們做過的努力再交流。謝謝！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
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 重組蛋白純化 |
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3樓2012-04-16 16:18:17
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 拋磚引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 拋磚引玉 2012-04-17 13:06:45
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我自己先提點意見，我們查閱大量資料，國內國外都有，有的認為是個死結。不用去理這個問題 。 但是我想，這是個很奇怪的問題， 第一，對于部分結合的蛋白很不理解，都是變性條件，為啥掛不到，如果是his不暴露，但是為啥有的暴露了？別忘了這是變性條件，沒有理由不露出來，而且之前用2-me處理過的，二硫鍵不是問題。 第二，國外國內有部分認做過實驗說不掛但是WB有結果，這說明his還在上面的，這點從部分掛的可以看出來，如果沒有his，就不會部分掛了。 第三，我們之前有個蛋白，可溶掛，但是他的包涵體部分掛的不明顯。這是很奇怪的事情。 我們認為這個蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身結構很獨特）導致his不完全暴露，那就有一個問題，什么結構能扛得住還原劑和8M尿素。 就當拋磚引玉吧，歡迎大家來拍啊 |
2樓2012-04-16 12:55:46
4樓2012-04-17 08:34:07
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 鼓勵發(fā)帖交流 2012-04-17 13:07:49
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 鼓勵發(fā)帖交流 2012-04-17 13:07:49
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樓主，變性條件下HIS標簽完全暴露，與柱材料結合的更加緊密，所以要用更高的咪唑才能洗脫，非變性的蛋白有時候想要完全洗脫都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不過是讓蛋白溶解。不能保證洗脫。未結合上不知樓主是用AKTA過的還是泵還是其他什么方式過的，可否讓柱材料與蛋白先孵育一段時間，再流出。樓主可以做個試驗，洗脫完后取10微升柱材料加入考馬斯亮藍看變色不，要是變色就說明蛋白未完全洗脫。如果未完全洗脫，可以用1M的咪唑試試。希望可以幫到你。 |
5樓2012-04-17 09:50:35
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