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[交流] 關(guān)于變性條件下his-tag重組融合蛋白不結(jié)合鎳柱以及部分結(jié)合鎳柱情況

最近做包涵體比較多，總體還好，但是遇到二個(gè)很棘手的問(wèn)題：
1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一點(diǎn)都不結(jié)合鎳柱
2：有些蛋白部分掛鎳柱，F(xiàn)T總是很多。

請(qǐng)各位在交流之前先看好下面的條件：
1，我們一次處理12個(gè)蛋白，有的是ok的，有的不掛，或者部分掛，因此排除什么pH，buffer，離子強(qiáng)度的問(wèn)題，因?yàn)槿绻沁@個(gè)問(wèn)題，那就是都不掛，或者都部分掛。當(dāng)然大家不用說(shuō)是蛋白需要不同buffer，如果你要說(shuō)這個(gè)因素，那我請(qǐng)問(wèn)你，你每次做鎳柱親和會(huì)用不同buffer嗎，有區(qū)別嗎？何況不管invotrogen還是novagen的標(biāo)準(zhǔn)protocol也是一個(gè)buffer，沒(méi)搞得花里胡哨的。這個(gè)版里面提這個(gè)問(wèn)題的很多，很多都是更換過(guò)buffer，絕對(duì)是無(wú)效的，我們自己也做過(guò)這方面的試驗(yàn)，沒(méi)結(jié)果，因此buffer不是問(wèn)題，我們是變性純化。

2，我們具體就是在洗滌包涵體后，用8M尿素溶解，同時(shí)加入10mM 2-me，在這里強(qiáng)調(diào)下，包涵體洗滌不是大問(wèn)題，溶解不是大問(wèn)題，我們基本都能溶解出來(lái)，電泳分析的結(jié)果。

3，我們binding buffer沒(méi)有加任何咪唑，沒(méi)有edta，剛開(kāi)始加入的b-me在上柱子前我們處理了，不會(huì)對(duì)鎳柱用影像，同時(shí)his-tag在N端，因此排除提前終止的可能。

4，我們實(shí)驗(yàn)室純化了快1000個(gè)蛋白了，因此低級(jí)的錯(cuò)誤在我們這里是不會(huì)的。我們每次試驗(yàn)時(shí)重復(fù)的，因此不用懷疑我們手法問(wèn)題，要不然不會(huì)做這么多。

科研有不確定因素，但是不是毫無(wú)規(guī)律可循，因此請(qǐng)大家結(jié)合自身經(jīng)驗(yàn)來(lái)討論這個(gè)問(wèn)題，而不是東一鋤頭，西一板斧的瞎提。請(qǐng)看清楚我們做過(guò)的努力再交流。謝謝！

[ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ]

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1樓 2012-04-16 12:39:49

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引用回帖:

3樓: Originally posted by ynkuaile at 2012-04-16 16:18:17:
樓主有沒(méi)有給柱材料檢測(cè)或跑膠看看，確定柱材料上沒(méi)有結(jié)合蛋白。樓主用什么濃度咪唑洗脫的，個(gè)人覺(jué)得結(jié)合不上可能性小，沒(méi)洗脫下來(lái)可能性大。

在變性條件下250mM足夠把蛋白洗脫下來(lái)，，而且蛋白不可能沉淀在柱子上，因?yàn)?M尿素，我之所以判斷不掛，是因?yàn)榱鱾鞔罅看罅康哪康牡鞍?

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4樓2012-04-17 08:34:07

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silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 拋磚引玉 2012-04-17 13:06:45

我自己先提點(diǎn)意見(jiàn)，我們查閱大量資料，國(guó)內(nèi)國(guó)外都有，有的認(rèn)為是個(gè)死結(jié)。不用去理這個(gè)問(wèn)題。

但是我想，這是個(gè)很奇怪的問(wèn)題，
第一，對(duì)于部分結(jié)合的蛋白很不理解，都是變性條件，為啥掛不到，如果是his不暴露，但是為啥有的暴露了？別忘了這是變性條件，沒(méi)有理由不露出來(lái)，而且之前用2-me處理過(guò)的，二硫鍵不是問(wèn)題。
第二，國(guó)外國(guó)內(nèi)有部分認(rèn)做過(guò)實(shí)驗(yàn)說(shuō)不掛但是WB有結(jié)果，這說(shuō)明his還在上面的，這點(diǎn)從部分掛的可以看出來(lái)，如果沒(méi)有his，就不會(huì)部分掛了。
第三，我們之前有個(gè)蛋白，可溶掛，但是他的包涵體部分掛的不明顯。這是很奇怪的事情。
我們認(rèn)為這個(gè)蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身結(jié)構(gòu)很獨(dú)特）導(dǎo)致his不完全暴露，那就有一個(gè)問(wèn)題，什么結(jié)構(gòu)能扛得住還原劑和8M尿素。

就當(dāng)拋磚引玉吧，歡迎大家來(lái)拍啊

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2樓2012-04-16 12:55:46

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
biowandy: 金幣+1, 謝謝參與，這種情況應(yīng)該不可能，因?yàn)槲蚁疵摰臅r(shí)候有8M尿素加上250mM咪唑，你覺(jué)得蛋白能扛得��？ 2012-04-17 08:29:31
silicare: 金幣+2 2012-04-17 13:07:20

樓主有沒(méi)有給柱材料檢測(cè)或跑膠看看，確定柱材料上沒(méi)有結(jié)合蛋白。樓主用什么濃度咪唑洗脫的，個(gè)人覺(jué)得結(jié)合不上可能性小，沒(méi)洗脫下來(lái)可能性大。

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3樓2012-04-16 16:18:17

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流 2012-04-17 13:07:49

引用回帖:

4樓: Originally posted by biowandy at 2012-04-17 08:34:07:
在變性條件下250mM足夠把蛋白洗脫下來(lái)，，而且蛋白不可能沉淀在柱子上，因?yàn)?M尿素，我之所以判斷不掛，是因?yàn)榱鱾鞔罅看罅康哪康牡鞍?

樓主，變性條件下HIS標(biāo)簽完全暴露，與柱材料結(jié)合的更加緊密，所以要用更高的咪唑才能洗脫，非變性的蛋白有時(shí)候想要完全洗脫都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不過(guò)是讓蛋白溶解。不能保證洗脫。未結(jié)合上不知樓主是用AKTA過(guò)的還是泵還是其他什么方式過(guò)的，可否讓柱材料與蛋白先孵育一段時(shí)間，再流出。樓主可以做個(gè)試驗(yàn)，洗脫完后取10微升柱材料加入考馬斯亮藍(lán)看變色不，要是變色就說(shuō)明蛋白未完全洗脫。如果未完全洗脫，可以用1M的咪唑試試。希望可以幫到你。

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5樓2012-04-17 09:50:35

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