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[交流]
關(guān)于變性條件下his-tag重組融合蛋白不結(jié)合鎳柱以及部分結(jié)合鎳柱情況
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最近做包涵體比較多，總體還好，但是遇到二個很棘手的問題： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一點都不結(jié)合鎳柱 2：有些蛋白部分掛鎳柱，F(xiàn)T總是很多。 請各位在交流之前先看好下面的條件： 1，我們一次處理12個蛋白，有的是ok的，有的不掛，或者部分掛，因此排除什么pH，buffer，離子強度的問題，因為如果是這個問題，那就是都不掛，或者都部分掛。 當(dāng)然大家不用說是蛋白需要不同buffer，如果你要 說這個因素，那我請問你，你每次做鎳柱親和會用不同buffer嗎，有區(qū)別嗎？ 何況不管invotrogen還是novagen的標(biāo)準(zhǔn)protocol也是一個buffer，沒搞得花里胡哨的。這個版里面提這個問題的很多，很多都是更換過buffer，絕對是無效的，我們自己也做過這方面的試驗，沒結(jié)果，因此buffer不是問題，我們是變性純化。 2，我們具體就是在洗滌包涵體后，用8M尿素溶解，同時加入10mM 2-me，在這里強調(diào)下，包涵體洗滌不是大問題，溶解不是大問題，我們基本都能溶解出來，電泳分析的結(jié)果。 3，我們binding buffer沒有加任何咪唑，沒有edta，剛開始加入的b-me在上柱子前我們處理了，不會對鎳柱用影像，同時his-tag在N端，因此排除提前終止的可能。 4，我們實驗室純化了快1000個蛋白了，因此低級的錯誤在我們這里是不會的。我們每次試驗時重復(fù)的，因此不用懷疑我們手法問題，要不然不會做這么多。 科研有不確定因素，但是不是毫無規(guī)律可循，因此請大家結(jié)合自身經(jīng)驗來討論這個問題，而不是東一鋤頭，西一板斧的瞎提。請看清楚我們做過的努力再交流。謝謝！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
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silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 拋磚引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 拋磚引玉 2012-04-17 13:06:45
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我自己先提點意見，我們查閱大量資料，國內(nèi)國外都有，有的認(rèn)為是個死結(jié)。不用去理這個問題 。 但是我想，這是個很奇怪的問題， 第一，對于部分結(jié)合的蛋白很不理解，都是變性條件，為啥掛不到，如果是his不暴露，但是為啥有的暴露了？別忘了這是變性條件，沒有理由不露出來，而且之前用2-me處理過的，二硫鍵不是問題。 第二，國外國內(nèi)有部分認(rèn)做過實驗說不掛但是WB有結(jié)果，這說明his還在上面的，這點從部分掛的可以看出來，如果沒有his，就不會部分掛了。 第三，我們之前有個蛋白，可溶掛，但是他的包涵體部分掛的不明顯。這是很奇怪的事情。 我們認(rèn)為這個蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身結(jié)構(gòu)很獨特）導(dǎo)致his不完全暴露，那就有一個問題，什么結(jié)構(gòu)能扛得住還原劑和8M尿素。 就當(dāng)拋磚引玉吧，歡迎大家來拍啊 |
2樓2012-04-16 12:55:46
3樓2012-04-16 16:18:17
11樓2012-04-18 08:31:07
4樓2012-04-17 08:34:07
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 鼓勵發(fā)帖交流 2012-04-17 13:07:49
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
silicare: 金幣+5, BioEPI+1, 鼓勵發(fā)帖交流 2012-04-17 13:07:49
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樓主，變性條件下HIS標(biāo)簽完全暴露，與柱材料結(jié)合的更加緊密，所以要用更高的咪唑才能洗脫，非變性的蛋白有時候想要完全洗脫都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不過是讓蛋白溶解。不能保證洗脫。未結(jié)合上不知樓主是用AKTA過的還是泵還是其他什么方式過的，可否讓柱材料與蛋白先孵育一段時間，再流出。樓主可以做個試驗，洗脫完后取10微升柱材料加入考馬斯亮藍(lán)看變色不，要是變色就說明蛋白未完全洗脫。如果未完全洗脫，可以用1M的咪唑試試。希望可以幫到你。 |
5樓2012-04-17 09:50:35
6樓2012-04-17 10:37:57
★ ★
silicare: 金幣+2, 把第三條刪掉吧，都是做過實驗才過來交流估計小木蟲就沒人了 2012-04-17 13:10:05
silicare: 金幣+2, 把第三條刪掉吧，都是做過實驗才過來交流估計小木蟲就沒人了 2012-04-17 13:10:05
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有個問題你應(yīng)該明白，沒有那個蛋白用250mM洗脫的時候一點都沒有，只會說需要500mM更好，但是250絕對是有的，對吧。 akta上出來的峰絕對是拖的， 絕對沒有只有在500mM下來，而在250沒有的蛋白。 第二載量不是問題，因為我是2ml介質(zhì)，不可能就那么點蛋白。 第四，你做過需要500-1M才洗脫的重組6his蛋白？ 實際的，不提理論上。就算你要提理論，請基于你的實驗數(shù)據(jù)推測。 另外我告訴你，不管哪家大公司的protocol沒有強調(diào)用500-1M的咪唑的，不信你拿一個大的公司的protocol欣賞下。 [ Last edited by biowandy on 2012-4-18 at 08:26 ] |
7樓2012-04-17 11:38:46
8樓2012-04-17 19:00:42
9樓2012-04-17 19:09:07
10樓2012-04-17 19:10:42
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最近實驗顯示，我們之前懷疑的很多不掛的，有一部分不是不掛，而是掛上了沒洗下來，這就很奇怪了，在尿素存在情況下，上柱子，洗脫，為啥還有不下來的，洗脫條件有尿素加上咪唑，也有ph加尿素，但是后者效果不如前者，雖然qiagen的protocol說這樣很好。 有一點，我們用的是國產(chǎn)的介質(zhì)， 不知道和這個有沒有關(guān)系？ 另外有部分確實是死活不掛， 對此結(jié)合一些文章和我們的試驗， 在尿素存在下， 包涵體雖然溶解了，但是結(jié)構(gòu)未必是一樣的， 對于那些蛋白經(jīng)過柱子后，有不掛的，有掛了洗下來的， 也有不下來的， 我想這三者應(yīng)該結(jié)構(gòu)不同。 |
12樓2012-05-24 12:48:25
13樓2012-05-24 14:44:13
14樓2012-11-13 09:34:47
15樓2014-01-15 10:29:13
16樓2014-07-09 11:09:44
17樓2016-11-21 21:53:34
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