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構(gòu)建質(zhì)粒時(shí) 質(zhì)粒上的ATG與目的基因ATG 的問題
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不知道各位在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，遇到這種情況： Nco I 位點(diǎn)處含有ATG密碼子時(shí)，使用的酶切位點(diǎn)為 B、C兩處，目的基因正向引物序列ACTCGAATCCATGGCAAGTTCG。 在氨基酸序列翻譯時(shí)，是從A處的ATG開始，而B處的ATG閱讀框發(fā)生改變？ |
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4樓2012-04-27 13:43:19
lxj341401
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2樓2012-04-26 20:20:45
susizheng
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有這么幾個(gè)問題， 1，EcoRI 酶切位點(diǎn)是GAATTC,不是GAATCC，估計(jì)是手誤。記得不要犯這種錯(cuò)誤哦，不然引物合成出來，載體構(gòu)建不成功都還知道是什么原因。 2，翻譯是從載體上ATG開始的，即是你標(biāo)記的A處，所以你的引物設(shè)計(jì)應(yīng)該在酶切位點(diǎn)后面加一個(gè)G，即GAATTC-G，這樣才能保證你的基因不移碼。 3，既然翻譯從載體上的ATG開始的，所以酶切位點(diǎn)后面可以不用再加你基因的ATG了。 4，EcoRI 酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基是CCG，當(dāng)然也有人說可以隨便加堿基，但個(gè)人認(rèn)為竟然有保護(hù)堿基表，還是按照標(biāo)準(zhǔn)來。 所以引物應(yīng)該是：CCG-GAATTC-G-GCAAGTTCG（后面再補(bǔ)幾個(gè)堿基吧，至少18個(gè)堿基配對(duì)啊，才9個(gè)，太摳了吧） |
3樓2012-04-26 20:27:19
susizheng
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5樓2012-04-27 21:02:10
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