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wuyuan1992金蟲 (正式寫手)
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[求助]
為什么做PCR時(shí)候模板濃度高了會(huì)擴(kuò)增不出目的片段？
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在做真菌ITS序列擴(kuò)增鑒定種屬的時(shí)候，師兄讓我將總DNA梯度稀釋，分別取原液、稀釋十倍、稀釋一百倍的總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。因?yàn)閼{師兄的經(jīng)驗(yàn)而談，有時(shí)候可能總DNA濃度太高會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不出，一次性梯度稀釋擴(kuò)增出目的產(chǎn)物的可能性會(huì)很高。 我想問的問題是： 1、為什么總DNA濃度高作為模板會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不出東西？ 2、PCR時(shí)對于模板的濃度有什么規(guī)定么？ 希望各位蟲友能夠幫忙解答，在此謝過～  |
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金蟲 (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wuyuan1992: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 非常感謝！我感覺很有道理～ 2012-07-26 07:45:19
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wuyuan1992: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 非常感謝！我感覺很有道理～ 2012-07-26 07:45:19
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同意樓上提的幾條 我考慮還有其他原因，如下 1 模板濃度過高，在退火時(shí)模板會(huì)和引物競爭，模板與模板互相結(jié)合 2 在前幾輪PCR反應(yīng)中，引物只是不斷反復(fù)和模板結(jié)合，和產(chǎn)物結(jié)合較少 3 模板濃度過高，最終電泳時(shí)會(huì)有條帶彌散 至于最佳濃度，參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南的說法，用哺乳動(dòng)物基因組DNA做模板時(shí)，每個(gè)PCR反應(yīng)所加入DNA約為1 微克，而酵母，細(xì)菌與質(zhì)粒DNA作為模板時(shí)，典型模板量應(yīng)為10 ng，1 ng和1 pg |
3樓2012-07-26 00:06:10
wuyuan1992
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5樓2012-07-26 07:45:50
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