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[求助]
引物設(shè)計區(qū)域選擇問題
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我設(shè)計兼并引物。多序列比對發(fā)現(xiàn)三個保守區(qū)。一個在中上游，一個在中游，一個在下游末。我準備選中上游和下游末分別設(shè)計上下游引物。但老師說選中游設(shè)計簡并引物就可以了。有經(jīng)驗的朋友能告訴我我該選哪個保守區(qū)設(shè)計引物嗎？設(shè)計多少對比較好？用來擴增未知基因保守區(qū)。 [ Last edited by 1949stone on 2012-8-20 at 07:49 ] |
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2樓2012-08-19 14:44:22
3樓2012-08-20 00:36:18
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設(shè)計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域，且兩個保守區(qū)域相距50～ 400個aa為宜，使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個保守區(qū)域至少有6個aa殘基，因為每條引物至少18bp左右。若比對結(jié)果保守性不是很強很可能找不到6個aa的保守區(qū)域，這時可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對�？傊�，究竟要選多少序列來比對，要根據(jù)前一次比對的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個6個aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。 |
4樓2012-08-20 17:32:12
5樓2012-08-20 17:33:36
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
fengyunqb: 金幣+2, ★★★★★最佳答案, 哈哈，萬分感謝。 2012-08-21 12:52:24
fengyunqb: 金幣+2, ★★★★★最佳答案, 哈哈，萬分感謝。 2012-08-21 12:52:24
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你僅僅知道氨基酸序列？或是其他物種的基因序列？ 你目前的情況，兼并引物已經(jīng)設(shè)計好，可以先試一下PCR，如果得到你的預(yù)期大小的片段，膠回收，連接T-vector，測序。 在做PCR擴增時，注意變換條件，特別是復(fù)性（退火）溫度，開始的時候先從溫度相對較低比如50-55度開始，多變幾個溫度，然后根據(jù)條帶調(diào)整條件。 也可以用降落PCR，不用理會復(fù)性溫度。 所用的核酸，DNA或者RNA一定要純，最好用適量，一般1000-10000個拷貝比較合適。如果是RNA，最好用mRNA。 最后，祝你好運！ |
6樓2012-08-20 23:08:09
7樓2012-08-24 16:16:07
8樓2012-09-01 17:29:19
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