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weiyasong木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
大家好，幫忙看看PCR結(jié)果吧？謝謝�。�！
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大家好，昨天跑的PCR結(jié)果： 1、第3條帶大約是多少��？ 2、第4條帶的目的片段是187bp，有目的條帶，但不是太清楚，而且引物很亮，這是怎么回事��？PCR反應(yīng)程序是94℃4min，94℃30s-56℃45s-72℃30s---30個(gè)循環(huán)，72℃5min 還請(qǐng)高人指教，小弟將不勝感激！謝謝�。。� 112.jpg |
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2樓2012-09-10 21:46:59
weiyasong
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3樓2012-09-10 21:53:12
【答案】應(yīng)助回帖
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對(duì)于問(wèn)題一：建議參照marker條帶位置（看一下marker的說(shuō)明書(shū)，應(yīng)該會(huì)有對(duì)應(yīng)的每條帶長(zhǎng)度說(shuō)明的），以及你設(shè)計(jì)時(shí)候的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，結(jié)合起來(lái)可以估計(jì)出第三條帶的大小。 對(duì)于問(wèn)題二：應(yīng)該是你擴(kuò)增的條件設(shè)置不夠理想，導(dǎo)致引物二聚體嚴(yán)重。建議提高退火問(wèn)題，或者是用touchdown（二階段溫度法）的方法（對(duì)于上下游引物TM值相差較大的情況）重新擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)該會(huì)有改善。 |
4樓2012-09-10 22:02:33
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5樓2012-09-10 22:08:38
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6樓2012-09-11 09:18:14
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從電泳鑒定膠圖看，您的擴(kuò)增條帶小于750BP的marker帶，建議最好是割膠回收后送測(cè)序，用測(cè)序結(jié)果再與你的預(yù)期序列比對(duì)，才能確認(rèn)擴(kuò)增條帶的特異性和擴(kuò)增引物的特異性。 touchdown(二階段溫度法)的應(yīng)用比較廣泛，你可以按照下面的程序試一下(由你的引物和基因長(zhǎng)度來(lái)定，注意如果引物TM值較高，那么可以提高起始的65度到68度，再往下每個(gè)循環(huán)降0.7度)，具體實(shí)驗(yàn)條件舉例見(jiàn)附件 touchdown程序.jpg |
7樓2012-09-11 13:30:42
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