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zhaoyu2881木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
單酶切連接轉(zhuǎn)化，感受態(tài)的問(wèn)題？！
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最近新做了一批DH5α感受態(tài)細(xì)胞，之后轉(zhuǎn)pBS在LB (amp+)平板上驗(yàn)證了可用。于是做質(zhì)粒酶切連接，試驗(yàn)如下： T1: pBS用EcoRV酶切后，插入目的基因；（insert / vecotor=3:1 or 5:1），轉(zhuǎn)化； CK1 : pBS用EcoRV酶切后，T4 DNA ligase （Fermentas） 自連，轉(zhuǎn)化；（為驗(yàn)證ligation reaction） CK2 ：直接轉(zhuǎn)化pBS （為再次驗(yàn)證感受態(tài)細(xì)胞） 后在LB （amp+）上做藍(lán)白斑篩選，可是每個(gè)平板上什么都不長(zhǎng)了��？這可能是什么原因呢，現(xiàn)在能確定ligase應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，是新的。 感受態(tài)細(xì)胞也是驗(yàn)證過(guò)的，只是在驗(yàn)證后在4度下放置了一晚，第二天保存在-80度冰箱，請(qǐng)問(wèn)會(huì)是因?yàn)檫@個(gè)原因影響了感受態(tài)的功能嗎？想了很多原因，覺(jué)得操作應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，這可能是什么導(dǎo)致的呢？ 急盼各位有經(jīng)驗(yàn)的前來(lái)指教��！謝謝！ |
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 實(shí)驗(yàn)操作 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhaoyu2881: 金幣+2, 謝謝你的回答。我是新做好的質(zhì)粒驗(yàn)證能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我現(xiàn)在也擔(dān)心是不是感受態(tài)的問(wèn)題？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-22 13:34:45
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhaoyu2881: 金幣+2, 謝謝你的回答。我是新做好的質(zhì)粒驗(yàn)證能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我現(xiàn)在也擔(dān)心是不是感受態(tài)的問(wèn)題？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-22 13:34:45
| 看了您的實(shí)驗(yàn)方案，沒(méi)什么問(wèn)題，如果酶切操作、DNA片段的回收都沒(méi)什么問(wèn)題，建議重新轉(zhuǎn)化（取來(lái)自超低溫冷凍的感受態(tài)，隨取隨用），我的經(jīng)驗(yàn)，放在4℃是絕對(duì)不行的，感受態(tài)在超低溫冰箱冷凍后，都是比較脆弱的，放在4℃條件下保存，肯定影響其效率（我們做的感受態(tài)都是放在-150℃保存）。 |
2樓2012-10-21 08:58:54
3樓2012-10-21 09:13:55
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6樓2012-10-21 16:11:23
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zhaoyu28817樓2012-10-21 16:42:53
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhaoyu2881: 金幣+3, 恩，非常感謝！看了大家的建議，回想了下實(shí)驗(yàn)操作，感覺(jué)還是有些小的細(xì)節(jié)沒(méi)有注意到~~打算重新再做了，呼呼~(yú)~ 2012-10-23 04:42:35
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhaoyu2881: 金幣+3, 恩，非常感謝！看了大家的建議，回想了下實(shí)驗(yàn)操作，感覺(jué)還是有些小的細(xì)節(jié)沒(méi)有注意到~~打算重新再做了，呼呼~(yú)~ 2012-10-23 04:42:35
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自己做的感受態(tài)，做好后直接分裝放-80冰箱保存。用的時(shí)候取一管做，如果要驗(yàn)證感受態(tài)問(wèn)題，取兩管，一管做轉(zhuǎn)化的，一個(gè)做對(duì)照�；旧弦晕业慕�(jīng)驗(yàn)說(shuō)，自己制作感受態(tài)只是效率問(wèn)題，有的人做的感受態(tài)板子上可能找的密密麻麻的好多，有的只是張100個(gè)或者很少的幾個(gè)，但基本上都說(shuō)陽(yáng)性的。 還有感受態(tài)不管是自作還是轉(zhuǎn)化，除了熱激過(guò)程，都說(shuō)需要冰上操作的。 以前見(jiàn)有的人說(shuō)，這個(gè)冰上操作甚至比無(wú)菌更重要（離心、懸浮等操作）。如果沒(méi)有冷凍離心機(jī)，我們之前是將小轉(zhuǎn)子放-20冰箱里凍冷，然后縮短離心時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速，也能制成很好的感受態(tài) |
10樓2012-10-22 18:21:23
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