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zhaoyu2881木蟲 (正式寫手)
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[求助]
單酶切連接轉(zhuǎn)化，感受態(tài)的問題？！
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最近新做了一批DH5α感受態(tài)細胞，之后轉(zhuǎn)pBS在LB (amp+)平板上驗證了可用。于是做質(zhì)粒酶切連接，試驗如下： T1: pBS用EcoRV酶切后，插入目的基因；（insert / vecotor=3:1 or 5:1），轉(zhuǎn)化； CK1 : pBS用EcoRV酶切后，T4 DNA ligase （Fermentas） 自連，轉(zhuǎn)化；（為驗證ligation reaction） CK2 ：直接轉(zhuǎn)化pBS （為再次驗證感受態(tài)細胞） 后在LB （amp+）上做藍白斑篩選，可是每個平板上什么都不長了��？這可能是什么原因呢，現(xiàn)在能確定ligase應(yīng)該沒有問題，是新的。 感受態(tài)細胞也是驗證過的，只是在驗證后在4度下放置了一晚，第二天保存在-80度冰箱，請問會是因為這個原因影響了感受態(tài)的功能嗎？想了很多原因，覺得操作應(yīng)該沒有問題，這可能是什么導(dǎo)致的呢？ 急盼各位有經(jīng)驗的前來指教！！謝謝！ |
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tulip1213
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhaoyu2881: 金幣+2, 謝謝你的回答。我是新做好的質(zhì)粒驗證能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我現(xiàn)在也擔(dān)心是不是感受態(tài)的問題？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵應(yīng)助 2012-10-22 13:34:45
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhaoyu2881: 金幣+2, 謝謝你的回答。我是新做好的質(zhì)粒驗證能用后，在4度放了一晚，然后就一直在-80下保存了，恩，我現(xiàn)在也擔(dān)心是不是感受態(tài)的問題？ 2012-10-21 10:38:55
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵應(yīng)助 2012-10-22 13:34:45
| 看了您的實驗方案，沒什么問題，如果酶切操作、DNA片段的回收都沒什么問題，建議重新轉(zhuǎn)化（取來自超低溫冷凍的感受態(tài)，隨取隨用），我的經(jīng)驗，放在4℃是絕對不行的，感受態(tài)在超低溫冰箱冷凍后，都是比較脆弱的，放在4℃條件下保存，肯定影響其效率（我們做的感受態(tài)都是放在-150℃保存）。 |
2樓2012-10-21 08:58:54
3樓2012-10-21 09:13:55
cicelyzh
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5樓2012-10-21 13:34:58
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