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高照李木蟲 (正式寫手)
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[求助]
求解PCR問題《忘記加水的前后》
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我要擴增昆蟲線粒體DNA的一個片段，前天做退火溫度的梯度PCR實驗時時侯忙中出錯忘記加水了（需定容至50微升），擴出的結果用瓊脂糖凝膠電泳檢測時發(fā)現(xiàn)有3 個溫度的樣本有片段（40-52度的梯度，41.6度、48度和50度的有，41.6度的最亮），且和需要的大小相近，其它溫度的樣本則沒有擴出。我又重新做了一遍退火溫度的梯度PCR（所有試劑都加好了無遺漏），但什么也沒出。 請問這是什么原因？請問哪位大俠知道。 |
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高照李
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多謝學長回復，我這兩天有重做了，溫度梯度還是沒做出來，模板濃度梯度、酶濃度梯度也做了還是沒出。引物空白對照也做了，引物沒問題。我做的是幾種昆蟲的DNA線粒體DNA COI片段，目的基因大小約600-700bp,用pcr擴增COI片段，50μl的擴增反應體系是： Premix Ex Taq 25μl 引物1（LCO1490)（20μM）1μl 引物2 (HCO2198)（20μM）1μl 模板1μl（<50ng）1μl 滅菌蒸餾水 22μl PCR反應程序：94℃預變性3min，94℃變性60s，50℃退火60s，72℃延伸60s，共35個循環(huán)，循環(huán)結束后，72℃延伸10min。 麻煩您能否幫我看一下，有可能是哪出的問題？ |
3樓2012-11-22 23:09:23
reallpf
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2樓2012-11-22 20:15:36
高照李4樓2012-11-22 23:18:32
zhaodahe
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5樓2012-11-22 23:36:56
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