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高照李木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
求解PCR問(wèn)題《忘記加水的前后》
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我要擴(kuò)增昆蟲(chóng)線(xiàn)粒體DNA的一個(gè)片段，前天做退火溫度的梯度PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)時(shí)侯忙中出錯(cuò)忘記加水了（需定容至50微升），擴(kuò)出的結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)有3 個(gè)溫度的樣本有片段（40-52度的梯度，41.6度、48度和50度的有，41.6度的最亮），且和需要的大小相近，其它溫度的樣本則沒(méi)有擴(kuò)出。我又重新做了一遍退火溫度的梯度PCR（所有試劑都加好了無(wú)遺漏），但什么也沒(méi)出。 請(qǐng)問(wèn)這是什么原因？請(qǐng)問(wèn)哪位大俠知道。 |
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高照李
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送鮮花一朵 7樓2012-11-23 11:46:00
reallpf
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
高照李: 回帖置頂 2012-11-23 21:43:33
高照李: 回帖置頂 2012-11-23 21:43:33
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你的問(wèn)題可能有2種情況 一是偶然情況，在實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)碰到相同的體系分裝幾管做PCR，僅僅因?yàn)榉诺奈恢貌煌Y(jié)果也不同。 二是你的PCR體系的緩沖液或者鎂離子的配比濃度有問(wèn)題，造成是否加水的不同結(jié)果。 所以碰到這樣的情況深究起來(lái)很復(fù)雜。建議還是重新優(yōu)化反應(yīng)體系和PCR條件。 在多個(gè)溫度梯度都沒(méi)有條帶且重復(fù)出現(xiàn)沒(méi)有條帶的情況下，需要調(diào)整引物特異性、退火時(shí)間、模版濃度和酶濃度。 |
2樓2012-11-22 20:15:36
高照李
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多謝學(xué)長(zhǎng)回復(fù)，我這兩天有重做了，溫度梯度還是沒(méi)做出來(lái)，模板濃度梯度、酶濃度梯度也做了還是沒(méi)出。引物空白對(duì)照也做了，引物沒(méi)問(wèn)題。我做的是幾種昆蟲(chóng)的DNA線(xiàn)粒體DNA COI片段，目的基因大小約600-700bp,用pcr擴(kuò)增COI片段，50μl的擴(kuò)增反應(yīng)體系是： Premix Ex Taq 25μl 引物1（LCO1490)（20μM）1μl 引物2 (HCO2198)（20μM）1μl 模板1μl（<50ng）1μl 滅菌蒸餾水 22μl PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，94℃變性60s，50℃退火60s，72℃延伸60s，共35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min。 麻煩您能否幫我看一下，有可能是哪出的問(wèn)題？ |
3樓2012-11-22 23:09:23
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4樓2012-11-22 23:18:32
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