 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4411 | 回復(fù): 8 | ||||
| 本帖產(chǎn)生 1 個 MolEPI ，點擊這里進行查看 | ||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | ||||
serena08新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
單酶切的大片段連接轉(zhuǎn)化及多個片段的連接轉(zhuǎn)化問題
|
|||
最近做的幾個克隆都非常不順，一個多月了，天天連接轉(zhuǎn)化涂板，天天收的空白板 一個涉及到多片段的連接：700bp+800bp+1.6kb+3.6kb 另一個是大片段單酶切連接（Pac I)：6.7kb+12kb 一直是懷疑連接的效率問題，單轉(zhuǎn)質(zhì)粒作為陽性對照確定感受態(tài)是好的。 具體：（1）多片段連接：確定多片段連接中的幾個片段都是酶切徹底的，跑膠，切膠做回收，用的QIAGEN的膠回收試劑盒，但回收率一般，小片段（<1kb)回收后濃度僅達20ng/ul。回收后片段做連接，用的是NEB的T4 DNA ligase，他家的快速連接試劑盒也有試過，均按說明操作（普通連接酶：10ul體系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室溫過夜后轉(zhuǎn)16度；快速連接試劑盒：同上一樣的體系，室溫5分鐘），均未有單菌落生長。 （2）大片段連接：6.7kb的insert質(zhì)粒和12kb載體質(zhì)粒均用PacI進行酶切，酶切后跑膠回收，載體片段回收效率很低，不到10ng/ul，insert片段也僅十幾ng/ul，同樣的用NEB的T4 DNA ligase做連接，10ul體系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室溫過夜后轉(zhuǎn)16度，未見有單克隆生長。 這段時間全耗在連接轉(zhuǎn)化上面了，嚴重打擊了我科研的信心  想求助一下大家在多片段的連接或大片段的連接轉(zhuǎn)化中都需要注意哪方面的問題呢？有大牛幫忙分析分析失敗的原因嗎？ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有54人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 單酶切連接轉(zhuǎn)化，感受態(tài)的問題？！
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 載體和酶切片段連接的問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 求助：Xho 1 單酶切 載體連接
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化問題
已經(jīng)有30人回復(fù)
- 雙酶切粘性末端連接不上
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 酶切后未純化連接出現(xiàn)的問題
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 大片段連接問題
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 本人做了雙酶切連接轉(zhuǎn)化，真的真的有想死的心了
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 做酶切連接后轉(zhuǎn)化再提質(zhì)粒，質(zhì)粒明顯變小，Why???
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 請教一下連接與轉(zhuǎn)化問題！
已經(jīng)有11人回復(fù)
- PCR ， 雙酶切，連接問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 單酶切連接......急
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 雙酶切連接表達載體，兩個月都沒做出來，問題到底出在哪里呢~？求指點
已經(jīng)有52人回復(fù)
- 為什么我做的酶切連接總是不長斑呢？
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于酶切連接轉(zhuǎn)化的問題
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】連接轉(zhuǎn)化長菌有質(zhì)粒，但是沒有目的片段，怎么回事？？
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 【求助/交流】酶切連接后的分子大小問題
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于酶切產(chǎn)物連接的一點問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助/交流】超大片段連接問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】大片段連接轉(zhuǎn)化成功與否問題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于克隆連接
已經(jīng)有15人回復(fù)
serena08
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 39.2
- 帖子: 35
- 在線: 23.6小時
- 蟲號: 2157146
- 注冊: 2012-11-30
- 性別: MM
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
|
首先非常感謝gyesang的熱心回帖！一早我就上來看是否有回帖，很欣喜，今天心情比昨天要好多了。下面就您的問題，我一一做個排查： 1. 做過單轉(zhuǎn)質(zhì)粒的陽性對照，雖然沒有每次都有這個陽性對照，但開始的時候是確定過抗性是對的，轉(zhuǎn)質(zhì)粒效率是沒有太大問題的，至于是不是超級感受態(tài)我真不敢肯定，用的是全式金的Trans-T1； 2. 對于第一個多片段，四個片段均不是PCR后直接酶切，都是從質(zhì)粒上酶切下來的...... 其中，前兩個700bp左右的是insert，最初也是PCR酶切，但后來也是為了排除PCR酶切可能不完全，所以又先構(gòu)到T載體中做了酶切回收，而后兩個3.6+1.6kb的片段是載體片段中切下來的，所以能確定待連接的片段酶切是完全的； 3. overlap PCR的方法沒做過，不知道是否可行，實現(xiàn)起來難度有多大？ 4. 連接酶是NEB的T4，之前訂的都被我用完了，所以最近做的這幾次是用的新訂的一支，可以考慮做個常規(guī)的連接排查一下連接酶的問題，先準備訂個fermentas的連接酶試試； 5. 您這個問題真是問到我心里去了，這個問題也非常困擾我，載體單酶切后并沒有做去磷酸化處理，為何連自連的都沒有能？？板子和感受態(tài)都有空轉(zhuǎn)質(zhì)粒載體的對照，確定沒問題。那么就是連接酶了。。。 另外，有推薦使用的超級感受態(tài)細胞嗎？國外品牌的沒法進口，但國內(nèi)的不清楚哪家的感受態(tài)做得最好？以前都是做的常規(guī)克隆，所以也沒遇到過這么多問題，請大家多交流指教了！ |
3樓2012-12-07 08:23:25
gyesang
榮譽版主 (著名寫手)
-
專家經(jīng)驗: +24 - MolEPI: 31
- 應(yīng)助: 599 (博士)
- 貴賓: 2.689
- 金幣: 24334.9
- 散金: 1088
- 紅花: 88
- 沙發(fā): 2
- 帖子: 2327
- 在線: 623.1小時
- 蟲號: 849017
- 注冊: 2009-09-16
- 性別: GG
- 專業(yè): 細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
- 管轄: 分子生物
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 回帖置頂 2012-12-06 20:08:34
amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵 2012-12-06 20:08:42
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 回帖置頂 2012-12-06 20:08:34
amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵 2012-12-06 20:08:42
|
樓主的第一個克隆難度的確是蠻大的，第二個還好， 1. 根據(jù)你的描述，總是空板，你有沒有測試過你轉(zhuǎn)化時用的感受態(tài)的效率，因為你是多片段和大片段連接，對感受態(tài)效率還是有一定要求的，最好用那種超級感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化比較好，因此，你首先測試下你的感受態(tài)細胞，同時用個陽性質(zhì)粒測試你的平板的抗性，你天天收白板，也可能是你用錯抗性平板了 2. 對于第一個多片段克隆，片段是不是太多了點，而且你是PCR產(chǎn)物直接酶切，你可以先把片段連上T-載體等中間載體，然后再酶切回收回來，這樣保證每一個片段都被充分酶切開，然后再多片段連試試 3.對于第一個多片段連接，樓主是不是也可考慮用Overlap PCR的方法，先把四個片段拼接為一個片段再往載體上連 4. 你大片段連接的過程和體系都是沒有問題的，但是你總是連接不上，會不會是所用連接酶有問題？ 5. 不知道樓主大片段連接是，載體單酶切后有沒有進行去磷酸化，如果沒有的話，連接后，板子上應(yīng)該會長很多克隆才對，這是載體自連導(dǎo)致的，是板子的問題還是感受態(tài)的問題，樓主可以排查一下 [ Last edited by gyesang on 2012-12-19 at 23:57 ] |
2樓2012-12-06 18:19:42
gyesang
榮譽版主 (著名寫手)
-
專家經(jīng)驗: +24 - MolEPI: 31
- 應(yīng)助: 599 (博士)
- 貴賓: 2.689
- 金幣: 24334.9
- 散金: 1088
- 紅花: 88
- 沙發(fā): 2
- 帖子: 2327
- 在線: 623.1小時
- 蟲號: 849017
- 注冊: 2009-09-16
- 性別: GG
- 專業(yè): 細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
- 管轄: 分子生物
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
|
1. 關(guān)于你的第一個克隆，我強烈建議你先用Overlap PCR的方法把片段連好，再往載體上構(gòu)建，從時間上， 比你在那撞運氣式的四片段連接肯定會快很多，主要缺點就是需要合成引物，浪費錢，但為了實驗，我們不在乎這點錢 2. 載體單酶切后并沒有做去磷酸化處理，且沒有自連，而且你的板子和感受態(tài)也驗證沒有問題，那你需要考慮換連接酶了，這里給你個推薦（絕對非廣告，因為我們實驗室一直用，就是覺的還可以），你可以去查查toyobo公司的ligation high這個連接酶 3. 關(guān)于感受態(tài)，我沒有什么建議的，我們都是實驗室自己做的感受態(tài)，專門人負責(zé)的，可能是經(jīng)常做的緣故吧，都到了如火純清的地步了，感受態(tài)基本沒出現(xiàn)過問題，且好用，至于哪個公司賣，還真不清楚 |
4樓2012-12-08 21:32:10
zd0017
鐵蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 122.7
- 帖子: 82
- 在線: 52.5小時
- 蟲號: 1282805
- 注冊: 2011-05-01
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
5樓2013-05-12 10:13:07
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 本科新能源科學(xué)與工程，一志愿華理能動285求調(diào)劑 +3 | AZMK 2026-03-27 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085600，材料與化工321分求調(diào)劑 +9 | 大饞小子 2026-03-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料與化工方向336分 +8 | 辰沐5211314 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 086502化學(xué)工程342求調(diào)劑 +6 | 阿姨復(fù)古不過 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +7 | 孅華 2026-03-22 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程求調(diào)劑 +9 | 多久上課 2026-03-27 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0856材料化工調(diào)劑 總分330 +10 | zhubinhao 2026-03-27 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +8 | 超級伊昂大王 2026-03-24 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 085600，材料與化工321分，求調(diào)劑 +9 | 大饞小子 2026-03-27 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 315調(diào)劑 +4 | 0860求調(diào)劑 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 一志愿 本科 北科大 化學(xué) 343 +6 | 13831862839 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +5 | 1() 2026-03-22 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +8 | Auroracx 2026-03-22 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿河工大 081700 276求調(diào)劑 +4 | 地球繞著太陽轉(zhuǎn) 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 機械學(xué)碩總分317求調(diào)劑�。。�！ +4 | Acaciad 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] B區(qū)考研調(diào)劑 +4 | yqdszhdap－ 2026-03-22 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 300分，材料，求調(diào)劑，英一數(shù)二 +5 | 超贊的 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +3 | desto 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 280分求調(diào)劑 一志愿085802 +4 | PUMPT 2026-03-22 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 315分，誠求調(diào)劑，材料與化工085600 +3 | 13756423260 2026-03-22 | 3/150 |
|