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serena08新蟲 (初入文壇)
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[求助]
單酶切的大片段連接轉(zhuǎn)化及多個片段的連接轉(zhuǎn)化問題
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最近做的幾個克隆都非常不順，一個多月了，天天連接轉(zhuǎn)化涂板，天天收的空白板 一個涉及到多片段的連接：700bp+800bp+1.6kb+3.6kb 另一個是大片段單酶切連接（Pac I)：6.7kb+12kb 一直是懷疑連接的效率問題，單轉(zhuǎn)質(zhì)粒作為陽性對照確定感受態(tài)是好的。 具體：（1）多片段連接：確定多片段連接中的幾個片段都是酶切徹底的，跑膠，切膠做回收，用的QIAGEN的膠回收試劑盒，但回收率一般，小片段（<1kb)回收后濃度僅達(dá)20ng/ul�；厥蘸笃巫鲞B接，用的是NEB的T4 DNA ligase，他家的快速連接試劑盒也有試過，均按說明操作（普通連接酶：10ul體系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室溫過夜后轉(zhuǎn)16度；快速連接試劑盒：同上一樣的體系，室溫5分鐘），均未有單菌落生長。 （2）大片段連接：6.7kb的insert質(zhì)粒和12kb載體質(zhì)粒均用PacI進(jìn)行酶切，酶切后跑膠回收，載體片段回收效率很低，不到10ng/ul，insert片段也僅十幾ng/ul，同樣的用NEB的T4 DNA ligase做連接，10ul體系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室溫過夜后轉(zhuǎn)16度，未見有單克隆生長。 這段時間全耗在連接轉(zhuǎn)化上面了，嚴(yán)重打擊了我科研的信心  想求助一下大家在多片段的連接或大片段的連接轉(zhuǎn)化中都需要注意哪方面的問題呢？有大牛幫忙分析分析失敗的原因嗎？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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gyesang
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1. 關(guān)于你的第一個克隆，我強(qiáng)烈建議你先用Overlap PCR的方法把片段連好，再往載體上構(gòu)建，從時間上， 比你在那撞運氣式的四片段連接肯定會快很多，主要缺點就是需要合成引物，浪費錢，但為了實驗，我們不在乎這點錢 2. 載體單酶切后并沒有做去磷酸化處理，且沒有自連，而且你的板子和感受態(tài)也驗證沒有問題，那你需要考慮換連接酶了，這里給你個推薦（絕對非廣告，因為我們實驗室一直用，就是覺的還可以），你可以去查查toyobo公司的ligation high這個連接酶 3. 關(guān)于感受態(tài)，我沒有什么建議的，我們都是實驗室自己做的感受態(tài)，專門人負(fù)責(zé)的，可能是經(jīng)常做的緣故吧，都到了如火純清的地步了，感受態(tài)基本沒出現(xiàn)過問題，且好用，至于哪個公司賣，還真不清楚 |
4樓2012-12-08 21:32:10
gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主的第一個克隆難度的確是蠻大的，第二個還好， 1. 根據(jù)你的描述，總是空板，你有沒有測試過你轉(zhuǎn)化時用的感受態(tài)的效率，因為你是多片段和大片段連接，對感受態(tài)效率還是有一定要求的，最好用那種超級感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化比較好，因此，你首先測試下你的感受態(tài)細(xì)胞，同時用個陽性質(zhì)粒測試你的平板的抗性，你天天收白板，也可能是你用錯抗性平板了 2. 對于第一個多片段克隆，片段是不是太多了點，而且你是PCR產(chǎn)物直接酶切，你可以先把片段連上T-載體等中間載體，然后再酶切回收回來，這樣保證每一個片段都被充分酶切開，然后再多片段連試試 3.對于第一個多片段連接，樓主是不是也可考慮用Overlap PCR的方法，先把四個片段拼接為一個片段再往載體上連 4. 你大片段連接的過程和體系都是沒有問題的，但是你總是連接不上，會不會是所用連接酶有問題？ 5. 不知道樓主大片段連接是，載體單酶切后有沒有進(jìn)行去磷酸化，如果沒有的話，連接后，板子上應(yīng)該會長很多克隆才對，這是載體自連導(dǎo)致的，是板子的問題還是感受態(tài)的問題，樓主可以排查一下 [ Last edited by gyesang on 2012-12-19 at 23:57 ] |
2樓2012-12-06 18:19:42
serena08
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
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首先非常感謝gyesang的熱心回帖！一早我就上來看是否有回帖，很欣喜，今天心情比昨天要好多了。下面就您的問題，我一一做個排查： 1. 做過單轉(zhuǎn)質(zhì)粒的陽性對照，雖然沒有每次都有這個陽性對照，但開始的時候是確定過抗性是對的，轉(zhuǎn)質(zhì)粒效率是沒有太大問題的，至于是不是超級感受態(tài)我真不敢肯定，用的是全式金的Trans-T1； 2. 對于第一個多片段，四個片段均不是PCR后直接酶切，都是從質(zhì)粒上酶切下來的...... 其中，前兩個700bp左右的是insert，最初也是PCR酶切，但后來也是為了排除PCR酶切可能不完全，所以又先構(gòu)到T載體中做了酶切回收，而后兩個3.6+1.6kb的片段是載體片段中切下來的，所以能確定待連接的片段酶切是完全的； 3. overlap PCR的方法沒做過，不知道是否可行，實現(xiàn)起來難度有多大？ 4. 連接酶是NEB的T4，之前訂的都被我用完了，所以最近做的這幾次是用的新訂的一支，可以考慮做個常規(guī)的連接排查一下連接酶的問題，先準(zhǔn)備訂個fermentas的連接酶試試； 5. 您這個問題真是問到我心里去了，這個問題也非常困擾我，載體單酶切后并沒有做去磷酸化處理，為何連自連的都沒有能？？板子和感受態(tài)都有空轉(zhuǎn)質(zhì)粒載體的對照，確定沒問題。那么就是連接酶了。。。 另外，有推薦使用的超級感受態(tài)細(xì)胞嗎？國外品牌的沒法進(jìn)口，但國內(nèi)的不清楚哪家的感受態(tài)做得最好？以前都是做的常規(guī)克隆，所以也沒遇到過這么多問題，請大家多交流指教了！ |
3樓2012-12-07 08:23:25
zd0017
鐵蟲 (小有名氣)
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5樓2013-05-12 10:13:07
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