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[求助] 平末端連接不上，求助

大家好，本人最近在做平末端連接，我的PCR產(chǎn)物是混合引物PCR結(jié)果，用的是東洋紡的KOD-PLUS-NEO酶，PCR產(chǎn)物用OMEGA膠回收試劑盒進行回收，30微升體積稀釋，回收后電泳檢測有特異單一條帶，濃度大約為150ng/ul，目的片段大小約為1500bp。接著進行連接，用的載體是全式金pEASY-blunt zero clonig KIT,連接體系5微升，包括2微升PCR產(chǎn)物，1微升載體，25度15min,之后50微升感受態(tài)轉(zhuǎn)化，涂板，過夜培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基為LB。培養(yǎng)后挑選白色菌落搖菌4小時M13引物菌液檢測，可是PCR檢測只有在100以下有個帶，完全沒有目的帶，已經(jīng)做了3次都是如此�，F(xiàn)在都不知道是什么問題，請求各位蟲子指點迷津，不勝感激！

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1樓 2012-12-19 10:34:53

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cicelyzh

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藍慧: 金幣+1, ★有幫助 2012-12-19 15:54:41

PCR檢測只有小于100的帶是引物二聚體吧。你做PCR有做陽性對照嗎？確定PCR條件合適？

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2樓2012-12-19 12:10:01

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-19 13:10:01
PCR檢測只有小于100的帶是引物二聚體吧。你做PCR有做陽性對照嗎？確定PCR條件合適？

我用的是M13的通用引物，但是沒有做過陽性對照，請教如何設(shè)計陽性對照？

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3樓2012-12-19 12:32:31

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藍慧: 金幣+1, ★有幫助 2012-12-19 19:32:16

你的連接體系不對吧？平端連接，載體一點點就夠了，片段要加大濃度

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4樓2012-12-19 16:26:47

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zhaodahe

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藍慧: 金幣+1 2012-12-19 19:32:25

具體說說你怎么PCR檢測的唄？模板太多了不容易擴增。你可以把質(zhì)�？斐榕茈娪荆瑥拇笮【湍芸闯鰜�。

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5樓2012-12-19 17:19:46

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5樓: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-19 18:19:46
具體說說你怎么PCR檢測的唄？模板太多了不容易擴增。你可以把質(zhì)�？斐榕茈娪�，從大小就能看出來。

PCR檢測是選白斑液體LB/AMP培養(yǎng)基搖4個小時，以1微升為模板，用rTaq PCR mix，M13F/M13R進行PCR，10微升體系，退火55度，30個循環(huán)。質(zhì)�？斐槭桥茈娪灸鞘遣皇翘舭装呔椭苯佑�2ml液體培養(yǎng)基培養(yǎng)直接抽提質(zhì)粒？如何操作呢？

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6樓2012-12-19 19:09:13

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4樓: Originally posted by 望海思月 at 2012-12-19 17:26:47
你的連接體系不對吧？平端連接，載體一點點就夠了，片段要加大濃度

載體是1微升，載體說明書上說是體積最好不超過5微升，片段濃度是150ng/ul左右，2微升。說明書建議是30ng就可以了，但經(jīng)咨詢試劑技術(shù)部，他說用2微升，然后自己也做了梯度，叢1微升到4微升，2微升是長的斑最好

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7樓2012-12-19 19:32:05

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6樓: Originally posted by 藍慧 at 2012-12-19 19:09:13
PCR檢測是選白斑液體LB/AMP培養(yǎng)基搖4個小時，以1微升為模板，用rTaq PCR mix，M13F/M13R進行PCR，10微升體系，退火55度，30個循環(huán)。質(zhì)�？斐槭桥茈娪灸鞘遣皇翘舭装呔椭苯佑�2ml液體培養(yǎng)基培養(yǎng)直接抽提質(zhì)粒？如何操 ...

我們都是菌落PCR，不會把培養(yǎng)基直接加到PCR體系中。質(zhì)�？斐橐彩怯玫墓腆w平板上的菌苔或者離去上清的菌體，然后加各種溶液，跑電泳比較大小。

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8樓2012-12-19 20:41:43

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3樓: Originally posted by 藍慧 at 2012-12-19 12:32:31
我用的是M13的通用引物，但是沒有做過陽性對照，請教如何設(shè)計陽性對照？...

陽性對照就是用隨便什么pUC18/19載體上插入過已知片段的質(zhì)粒。經(jīng)常做克隆的，總有這樣的質(zhì)粒吧。

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9樓2012-12-20 08:50:35

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9樓: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-20 09:50:35
陽性對照就是用隨便什么pUC18/19載體上插入過已知片段的質(zhì)粒。經(jīng)常做克隆的，總有這樣的質(zhì)粒吧。...

有，謝謝！

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10樓2012-12-20 09:01:23

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