碧海行帆

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[求助] 真菌轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證問(wèn)題

跟大家探討一個(gè)問(wèn)題，我做真菌的基因敲除，目前得到了24個(gè)轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR驗(yàn)證的時(shí)候，抗性基因也就是陽(yáng)性對(duì)照成功擴(kuò)出，要敲除的目的基因都沒(méi)有擴(kuò)出，按理說(shuō)應(yīng)該是都敲除了，但轉(zhuǎn)化率達(dá)到了100%，大家說(shuō)有這種可能嗎？？？

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1樓 2013-01-05 17:35:48

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你用抗性做篩選標(biāo)記，假的都死了，出來(lái)假的才不對(duì)吧。

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2樓2013-01-05 20:36:31

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cicelyzh

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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-07 16:51:20

如果有抗性基因而要敲除的基因還在的話才有問(wèn)題，那說(shuō)明不能用抗性基因來(lái)篩選目的基因了。此外，我覺得你最好不要用PCR負(fù)結(jié)果來(lái)證明敲除基因不在了，應(yīng)該用敲除基因序列兩端的DNA序列做PCR，確定突變株的帶（含抗性基因）位置和野生型不同，并且不含野生型的帶。

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3樓2013-01-06 02:27:42

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2樓: Originally posted by zhaodahe at 2013-01-05 20:36:31
你用抗性做篩選標(biāo)記，假的都死了，出來(lái)假的才不對(duì)吧。

嗯，但也有抗性基因轉(zhuǎn)進(jìn)去了，目的基因沒(méi)轉(zhuǎn)進(jìn)去的情況啊

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4樓2013-01-06 11:43:47

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3樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 02:27:42
如果有抗性基因而要敲除的基因還在的話才有問(wèn)題，那說(shuō)明不能用抗性基因來(lái)篩選目的基因了。此外，我覺得你最好不要用PCR負(fù)結(jié)果來(lái)證明敲除基因不在了，應(yīng)該用敲除基因序列兩端的DNA序列做PCR，確定突變株的帶（含抗性 ...

嗯，有道理，我用敲除基因序列兩端的DNA序列做PCR驗(yàn)證了，但結(jié)果是非特異性條帶，沒(méi)有單一的條帶，而且目的基因擴(kuò)增了很多次均為擴(kuò)出，所以說(shuō)我現(xiàn)在很疑惑啊

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5樓2013-01-06 11:46:15

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能文獻(xiàn)你用的什么真菌，什么報(bào)告基因，什么篩選標(biāo)記么？真菌比較特殊，假陽(yáng)性非常多，問(wèn)題還需詳細(xì)些，真菌100%轉(zhuǎn)化效率是不可能的。

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6樓2013-01-06 13:03:23

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haiwoshishui

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碧海行帆: 金幣+1 2013-01-08 15:00:27

我的基因敲除300多個(gè)轉(zhuǎn)化子才有16株是敲除的。你怎么才得到這么少的轉(zhuǎn)化子并且都是敲除的呢？可以做雜交進(jìn)一步驗(yàn)證一下。PS：你要不要做回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)？有木有合適的回補(bǔ)載體？我正為回補(bǔ)載體的事犯愁呢。

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7樓2013-01-06 13:25:40

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5樓: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-06 11:46:15
嗯，有道理，我用敲除基因序列兩端的DNA序列做PCR驗(yàn)證了，但結(jié)果是非特異性條帶，沒(méi)有單一的條帶，而且目的基因擴(kuò)增了很多次均為擴(kuò)出，所以說(shuō)我現(xiàn)在很疑惑啊...

你說(shuō)的非特異條帶是在野生型還是突變株里擴(kuò)出來(lái)的？是引物的問(wèn)題嗎？你敲除的目的基因是否有其它同源基因呢？

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8樓2013-01-06 13:58:21

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6樓: Originally posted by xj8442cn at 2013-01-06 13:03:23
能文獻(xiàn)你用的什么真菌，什么報(bào)告基因，什么篩選標(biāo)記么？真菌比較特殊，假陽(yáng)性非常多，問(wèn)題還需詳細(xì)些，真菌100%轉(zhuǎn)化效率是不可能的。

我做的是鐮刀菌，用潮霉素做篩選標(biāo)記，目的基因PCR了很多次，都擴(kuò)不出，但野生型能擴(kuò)出，覺得奇怪啊

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9樓2013-01-06 17:54:09

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7樓: Originally posted by haiwoshishui at 2013-01-06 13:25:40
我的基因敲除300多個(gè)轉(zhuǎn)化子才有16株是敲除的。你怎么才得到這么少的轉(zhuǎn)化子并且都是敲除的呢？可以做雜交進(jìn)一步驗(yàn)證一下。PS：你要不要做回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)？有木有合適的回補(bǔ)載體？我正為回補(bǔ)載體的事犯愁呢。

你是如何驗(yàn)證的啊，做了幾次PCR呀？我的載體是老師管別人要的

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10樓2013-01-06 17:59:57

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