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[求助]
酶活測(cè)定問(wèn)題請(qǐng)教
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| 最近在做一個(gè)原核表達(dá)蛋白的酶活測(cè)定，具體是將鎳柱純化獲得的蛋白通過(guò)與NADH偶聯(lián)來(lái)檢測(cè)其活性，為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每次純化的蛋白樣品都做3個(gè)平行，結(jié)果沒(méi)什么問(wèn)題。但是不同批次純化到的蛋白測(cè)定的酶活結(jié)果卻不能很好的平行，這是為什么呢？純化過(guò)程和酶活測(cè)定方法都是按照相同的步驟來(lái)做的。不知道有沒(méi)有蟲(chóng)友也遇到過(guò)類似的問(wèn)題。。。。求助�。。。〖保。� |
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buggiegoat
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9樓2013-01-22 23:57:06
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2樓2013-01-18 21:30:29
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1.三個(gè)平行樣是同一批次純化到的蛋白，測(cè)定沒(méi)什么問(wèn)題，現(xiàn)在的問(wèn)題是批次間無(wú)法平行 2.至于你說(shuō)的不同批次純化前的原核樣品的量（OD值）----是菌體濃度嗎?這個(gè)我倒是沒(méi)有測(cè)過(guò)，還有就是每次純化到的蛋白含量之間也有一定的差別，這個(gè)對(duì)我測(cè)定的比活力影響大嗎？ 3.我都是將配好的反應(yīng)體系搖勻后再反應(yīng)的，這個(gè)應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題 因?yàn)槲液竺孢�要繼續(xù)做點(diǎn)突變尋找酶的活性中心，所以希望現(xiàn)在把數(shù)據(jù)做穩(wěn)定方便以后參考，但是現(xiàn)在我的批次間無(wú)法對(duì)應(yīng)，那我以后每做一個(gè)點(diǎn)突變都得把原始的蛋白表達(dá)一次，那樣太麻煩了。。。。。 |
3樓2013-01-19 00:14:38
buggiegoat
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4樓2013-01-19 09:35:51
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