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[求助] QPCR之引物設(shè)計(jì)(二)

大家好，我做QPCR擴(kuò)增效率的時(shí)候遇到一個(gè)基因，之前測(cè)得的CT值是30左右，退火溫度是54度，溶解曲線如圖1。
我現(xiàn)在補(bǔ)做擴(kuò)增效率，體系試劑什么都是一樣的，可是測(cè)得的相同樣品的CT值基本都在33左右我試過51-57度退火溫度，擴(kuò)增效率很低，連擬合度都不好，CT值比較低，我用的是2倍稀釋度，怕是稀釋不準(zhǔn)，后來重復(fù)了幾次，但結(jié)果依然不是很好。溶解曲線如圖2。
大家看這是什么原因呢，感覺引物質(zhì)量是還好吧？是要換引物嗎？

圖2.jpg

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1樓 2013-03-06 16:42:43

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7樓: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-08 21:32:43
梯度濃度里有個(gè)濃度是以前的濃度，以前CT值是30，現(xiàn)在只有33了，5倍這個(gè)濃度的CT值也大于30。...

一般來說，最稀的樣品CT不超過33的話問題不是很大。如果CT超過35的話就不好說了。你測(cè)的擴(kuò)增效率有多少？

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8樓2013-03-09 01:16:52

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+2 2013-03-07 13:15:03

同一cDNA經(jīng)過凍化CT值會(huì)有一點(diǎn)變大。如果做相對(duì)定量的話問題不是很大，因?yàn)閮?nèi)參的CT也會(huì)變大。至于你說的溫度梯度，一般是考慮在不同退火溫度下的特異性和擴(kuò)增效率。你的熔解曲線說明產(chǎn)物單一，特異性是不錯(cuò)的。至于擴(kuò)增效率，要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的CT來計(jì)算。

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2樓2013-03-07 09:48:56

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shiliyusly: 金幣+1 2013-03-07 13:15:09

循環(huán)數(shù)偏大，可以通過稍微調(diào)整一下DNA濃度調(diào)整。
做擴(kuò)增效率需要用質(zhì)粒DNA作模板，如果SLOPE可以，但是擴(kuò)增效率太低，那就需要換引物。

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3樓2013-03-07 09:51:33

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA經(jīng)過凍化CT值會(huì)有一點(diǎn)變大。如果做相對(duì)定量的話問題不是很大，因?yàn)閮?nèi)參的CT也會(huì)變大。至于你說的溫度梯度，一般是考慮在不同退火溫度下的特異性和擴(kuò)增效率。你的熔解曲線說明產(chǎn)物單一，特異性是不錯(cuò)的。至于 ...

我做擴(kuò)增效率是把原濃度模板稀釋2倍，做4個(gè)梯度，再根據(jù)濃度和CT值做的曲線，儀器給出的擴(kuò)增效率值不高

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4樓2013-03-07 13:13:24

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還有哦，我其他基因也是相同的方法，他們的CT值和之前相比就沒什么區(qū)別的，這是為什么

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5樓2013-03-07 13:14:56

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引用回帖:

5樓: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-07 13:14:56
還有哦，我其他基因也是相同的方法，他們的CT值和之前相比就沒什么區(qū)別的，這是為什么...

做擴(kuò)增效率的時(shí)候CT值是在20-30之間嗎？
如果這個(gè)基因的CT有變化而其它基因的沒什么區(qū)別，可能是因?yàn)檫@個(gè)基因的結(jié)構(gòu)問題，造成cDNA相對(duì)不穩(wěn)定。這種情況不是很常見。

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6樓2013-03-08 06:37:00

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6樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 06:37:00
做擴(kuò)增效率的時(shí)候CT值是在20-30之間嗎？
如果這個(gè)基因的CT有變化而其它基因的沒什么區(qū)別，可能是因?yàn)檫@個(gè)基因的結(jié)構(gòu)問題，造成cDNA相對(duì)不穩(wěn)定。這種情況不是很常見。...

梯度濃度里有個(gè)濃度是以前的濃度，以前CT值是30，現(xiàn)在只有33了，5倍這個(gè)濃度的CT值也大于30。

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7樓2013-03-08 21:32:43

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8樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-09 01:16:52
一般來說，最稀的樣品CT不超過33的話問題不是很大。如果CT超過35的話就不好說了。你測(cè)的擴(kuò)增效率有多少？...

最好的一次退火溫度是62%，但是擬合度只有0.896，后來我模板有重新稀釋還換了一個(gè)但是還是不好。

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9樓2013-03-09 09:13:37

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★ ★ ★ ★ ★
shiliyusly: 金幣+3 2013-03-09 15:00:31
shiliyusly: 金幣+2, 2 2013-03-12 21:40:18

引用回帖:

9樓: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-09 09:13:37
最好的一次退火溫度是62%，但是擬合度只有0.896，后來我模板有重新稀釋還換了一個(gè)但是還是不好。...

差不多有90%，應(yīng)該能湊合著用。實(shí)在不喜歡就換引物試試。

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10樓2013-03-09 11:09:28

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