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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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QPCR之引物設(shè)計(jì)(二)
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大家好，我做QPCR擴(kuò)增效率的時(shí)候遇到一個(gè)基因，之前測(cè)得的CT值是30左右，退火溫度是54度，溶解曲線如圖1。 我現(xiàn)在補(bǔ)做擴(kuò)增效率，體系試劑什么都是一樣的，可是測(cè)得的相同樣品的CT值基本都在33左右我試過(guò)51-57度退火溫度，擴(kuò)增效率很低，連擬合度都不好，CT值比較低，我用的是2倍稀釋度，怕是稀釋不準(zhǔn)，后來(lái)重復(fù)了幾次，但結(jié)果依然不是很好。溶解曲線如圖2。 大家看這是什么原因呢，感覺(jué)引物質(zhì)量是還好吧？是要換引物嗎？ 圖2.jpg 圖1.jpg |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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chenguestc
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3樓2013-03-07 09:51:33
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+2 2013-03-07 13:15:03
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| 同一cDNA經(jīng)過(guò)凍化CT值會(huì)有一點(diǎn)變大。如果做相對(duì)定量的話問(wèn)題不是很大，因?yàn)閮?nèi)參的CT也會(huì)變大。至于你說(shuō)的溫度梯度，一般是考慮在不同退火溫度下的特異性和擴(kuò)增效率。你的熔解曲線說(shuō)明產(chǎn)物單一，特異性是不錯(cuò)的。至于擴(kuò)增效率，要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的CT來(lái)計(jì)算。 |
2樓2013-03-07 09:48:56
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4樓2013-03-07 13:13:24
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5樓2013-03-07 13:14:56
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