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huajin2628金蟲 (正式寫手)
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[求助]
感受態(tài)的制備
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| 求感受態(tài)制備注意事項(xiàng)和經(jīng)驗(yàn)！ |
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goudan880220
銅蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-07-18 14:44:20
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| 氯化鈣法（Calcium Chloride）本方法適用于批量制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，所得感受態(tài)細(xì)胞可以獲得5 x 106 到 2x 107 轉(zhuǎn)化克隆/微克超螺旋質(zhì)粒DNA材料（MATERIALS）緩沖液和溶液（Buffers and Solutions）（冰冷的）CaCl2•2H2O (1 M)冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold)培養(yǎng)基（Media）用于初始培養(yǎng)物培養(yǎng)的LB肉湯（L-broth for initial growth of culture）LB agar plates containing appropriate antibiotic核酸（Nucleic Acids）質(zhì)粒DNA （Plasmid DNA）或經(jīng)過重組的質(zhì)粒（recombinant plasmid）方法1.從37°C過夜(16-20 hours)培養(yǎng)平皿內(nèi)挑取一個(gè)直徑約為2到3毫米的單菌落。把這樣的單菌落接種于一只裝有5毫升LB肉湯的30毫升滅菌試管中，于37°C下振蕩培養(yǎng)過夜。2. 轉(zhuǎn)移0.2毫升過夜培養(yǎng)物于一只裝有15或20毫升LB的50毫升滅菌三角瓶中. 于37°C下振蕩培養(yǎng)2到2.5小時(shí)（此時(shí)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期）。3. 室溫下，4000 rpm離心5分鐘收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞。 棄培養(yǎng)基，保留細(xì)胞沉淀。5. 加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液，并輕微打勻。6. 4°C下，4000 rpm離心10分鐘收集細(xì)胞。7. 棄MgCl2-CaCl2 溶液，保留細(xì)胞沉淀。8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培養(yǎng)物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并輕微打勻。冰浴放置若干小時(shí)為最好。9. 此時(shí)的感受態(tài)細(xì)胞可以依照下面的步驟10到16直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，也可以分裝,加入甘油后于-70°C冰凍保藏。10. 向事先滅菌，并經(jīng)冷處理的1.5ml 聚丙烯管中轉(zhuǎn)移100微升感受態(tài)細(xì)胞懸浮液。向每個(gè)轉(zhuǎn)化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的體積中所含量應(yīng)不超過50納克)。細(xì)心混勻管中成份。于冰浴放置30到40分鐘。11. 把轉(zhuǎn)化管轉(zhuǎn)移至放于42°C循環(huán)水浴鍋中預(yù)熱的試管架上，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)90秒。（此時(shí)不能搖動(dòng)轉(zhuǎn)化管）12. 把試管迅速轉(zhuǎn)移至冰浴2到3分鐘。13. 向每只試管中加入500微升LB肉湯。37°C放置45到90分鐘，以使細(xì)菌復(fù)原，并容許質(zhì)粒所編碼的抗生素抗性的表達(dá)。14. 轉(zhuǎn)移適量體積（如果使用90毫米平板，一半涂布量不應(yīng)超過100微升）的經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有 相應(yīng)抗生素的LB-瓊脂平板上。15. 室溫放置平板直到其上液體被吸收。16. 于37°C倒置平板培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化克隆應(yīng)該于12-16 小時(shí)區(qū)間出現(xiàn)。 |
2樓2013-03-09 22:39:41
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-07-18 14:44:32
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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以前做感受態(tài)時(shí)找的資料，希望對(duì)你有用 另外木蟲里有蠻多這方面的資料的，搜一下看看吧，祝實(shí)驗(yàn)順利 |
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2013-03-10 09:06:32, 5.36 M
3樓2013-03-10 09:07:39
4樓2013-07-18 09:10:19
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