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real-time引物設(shè)計(jì)問題，關(guān)于保守取，內(nèi)含子
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real-time引物設(shè)計(jì)問題，怎么弄么？說的是要在保守區(qū)設(shè)計(jì)，但是保守取是那部分呢？怎么找？還有就是要跨內(nèi)含子……怎么知道哪兒有內(nèi)含子啊 |
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gyesang: 回帖置頂 2013-04-26 21:25:29
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gyesang: 回帖置頂 2013-04-26 21:25:29
| NCBI上每個(gè)核酸序列信息的旁邊有個(gè)Pick Primer 點(diǎn)進(jìn)去，把你自己設(shè)計(jì)好的引物輸進(jìn)去，然后看看結(jié)果是不是跨內(nèi)含子的。不過要求的跨內(nèi)含子是針對(duì)RNA表達(dá)量檢測(cè)的。如果是檢測(cè)菌的數(shù)量等DNA水平的話，就不需要了。至于所謂的保守，我就不清楚了，你的試驗(yàn)?zāi)康牟煌�，real time 的引物要求也不同的。不要死扣那些引物設(shè)計(jì)規(guī)則。祝你好運(yùn)吧 |
2樓2013-03-30 12:05:01
3樓2013-03-30 21:55:44
stt19890101
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4樓2013-03-31 09:54:37
chnfhjxl
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序列下面有紅色的區(qū)域，紅色的是蛋白質(zhì)編碼區(qū)，也就是外顯子區(qū)域，然后去查查這個(gè)基因DNA的信息，就知道是不是跨內(nèi)含子了。一般在外顯子區(qū)域內(nèi)的大多都可以跨內(nèi)含子了。 其實(shí)所謂跨內(nèi)含子只不過是為了防止你RNA 中含有DNA。其實(shí)最簡(jiǎn)單的辦法是在RNA提取后加DNA酶消化過程，或者做一個(gè)不反轉(zhuǎn)錄直接PCR的對(duì)照，如果也P的出來就說明你的熒光定量要用跨內(nèi)含子的引物了。 |
5樓2013-03-31 12:17:22
6樓2013-03-31 13:44:00
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7樓2013-04-01 18:33:20
意孤城_
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你先在NCBI上找到該基因的DNA序列，然后再找他的mRNA序列 兩個(gè)一比較就可以找到每一個(gè)外顯子的序列，設(shè)計(jì)引物建議選擇在兩個(gè)外顯子連接處設(shè)計(jì)（這樣可以保證有DNA污染的情況下也不結(jié)合到DNA上），可以增加特異性。 有的人說擴(kuò)約一個(gè)內(nèi)含子，但這種效果不是很好（因?yàn)榧皶r(shí)你跨越了一個(gè)內(nèi)含子，但是上下游引物剛好在兩個(gè)相鄰的外顯子上，剛好跨越的那個(gè)內(nèi)含子大小又<150bp,那么有DNA污染的情況下你還是能夠擴(kuò)增出條帶，不特意了就） 希望對(duì)你有幫助 我前兩天剛設(shè)計(jì) |
8樓2013-04-02 10:05:31
9樓2013-04-02 10:47:01
意孤城_
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我沒看懂你什么意思。有的基因的轉(zhuǎn)錄本有差異就會(huì)有好幾種不同的外顯子構(gòu)型（比如有的是包含10個(gè)外顯子，有的卻是包含8個(gè)外顯子）那么最好選擇共有那部分外顯子上設(shè)計(jì)引物。一段cDNA上肯定包含很多個(gè)外顯子就必然會(huì)有很多個(gè)內(nèi)含子對(duì)應(yīng)在DNA上，這個(gè)選哪個(gè)影響倒不是很大，如我剛才說的。如果沒有合適的跨越外顯子連接處的引物可以考慮跨一個(gè)大于1000bp以上的內(nèi)含子（PCR是延伸時(shí)間比較短，這樣即使有DNA污染，結(jié)合到DNA上由于延伸時(shí)間問題也不會(huì)出現(xiàn)雜帶） |
10樓2013-04-02 20:36:24
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