 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 7 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4454 | 回復(fù): 6 | ||||
weizhi111至尊木蟲 (正式寫手)
|
[求助]
HIS標(biāo)簽的蛋白不掛柱，求助
|
|
我表達(dá)的蛋白純化時(shí)蛋白出現(xiàn)在穿透液里，還比較濃，附件中的膠圖從左向右第6個(gè)泳道是穿透液，第7，8，9是洗脫下來的蛋白，最后一個(gè)泳道是洗脫完后柱子上殘余的（我可能沒有洗脫完全）。穿透液中損失掉的占了大部分， 是因?yàn)榈鞍讙熘缓脝�？有什么方法改進(jìn)一下嗎？說明：我的蛋白是在包涵體中的，我用了8M尿素水溶液過夜溶解，第二天抽濾才上樣的。banding buffer中含有10mM咪唑，洗脫液含有500mM咪唑，這兩種buffer中都加了8M尿素，pH=8.0�？偣�7ml 樣品用了2ml填料。我后來把穿透液重新又用bangding buffe混合，分成了3個(gè)柱子（重新加了填料）又過了一遍（搖床上混了好幾個(gè)小時(shí)），洗脫下來的還是很少。求各位有經(jīng)驗(yàn)的大俠指教！ chunhua brm-3-29.jpg |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 蛋白表達(dá)純化與檢測(cè) |
» 猜你喜歡
299求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
286分人工智能專業(yè)請(qǐng)求調(diào)劑愿意跨考！
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
279求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
336求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
286求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
一志愿華中科技大學(xué)071000，求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
279分求調(diào)劑 一志愿211
已經(jīng)有14人回復(fù)
-
332求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
0856材料專碩353求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
材料學(xué)學(xué)碩080502 337求調(diào)劑-一志愿華中科技大學(xué)
已經(jīng)有5人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 請(qǐng)問His-tag（組氨酸標(biāo)簽）怎么加到我的蛋白上去？
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 蛋白質(zhì)的Ni柱純化問題
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 求助各位大神關(guān)于含組氨酸標(biāo)簽蛋白純化的問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- His標(biāo)簽的蛋白純化柱子
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 帶HIS標(biāo)簽的可溶蛋白的純化問題
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 關(guān)于變性條件下his-tag重組融合蛋白不結(jié)合鎳柱以及部分結(jié)合鎳柱情況
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 過帶his標(biāo)簽的蛋白時(shí)鎳柱上樣后顏色變棕色是怎么回事
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 蛋白純化問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 已經(jīng)帶his標(biāo)簽?zāi)康牡鞍谆蛉绾卧O(shè)計(jì)引物�。康幕蛞呀�(jīng)接在pET-22b的載體上了）
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 融合蛋白不掛柱，急！
已經(jīng)有7人回復(fù)
- TEV酶的純化出問題了，求解？？、
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 目的蛋白加myc或his標(biāo)簽？
已經(jīng)有10人回復(fù)
- his標(biāo)簽蛋白純化，不掛柱
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于his-tagged 蛋白純化
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】重組蛋白融合標(biāo)簽的選擇
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】His標(biāo)簽
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】蛋白不掛柱怎么辦
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 基因帶六個(gè)his標(biāo)簽，蛋白純化時(shí)為何掛不上鎳柱
已經(jīng)有26人回復(fù)
2樓2013-03-31 00:40:54
weizhi111
至尊木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 11470.4
- 散金: 158
- 紅花: 1
- 帖子: 722
- 在線: 123小時(shí)
- 蟲號(hào): 2144809
- 注冊(cè): 2012-11-24
- 專業(yè): 昆蟲學(xué)
3樓2013-03-31 09:09:26
joan198108
鐵桿木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 1
- 應(yīng)助: 107 (高中生)
- 金幣: 6525.2
- 散金: 12
- 紅花: 3
- 帖子: 842
- 在線: 413.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 859607
- 注冊(cè): 2009-09-29
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物技術(shù)藥物
4樓2013-03-31 09:38:18
weizhi111
至尊木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 11470.4
- 散金: 158
- 紅花: 1
- 帖子: 722
- 在線: 123小時(shí)
- 蟲號(hào): 2144809
- 注冊(cè): 2012-11-24
- 專業(yè): 昆蟲學(xué)
5樓2013-03-31 19:11:25
凌波麗
專家顧問 (知名作家)
-
專家經(jīng)驗(yàn): +218 - BioEPI: 11
- 應(yīng)助: 397 (碩士)
- 貴賓: 0.044
- 金幣: 2118.9
- 散金: 10
- 紅花: 208
- 帖子: 5633
- 在線: 571.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 1766465
- 注冊(cè): 2012-04-19
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學(xué)綜合
|
我今天剛錄入好，回答別人的一個(gè)類似問題，順便貼在此處，以供參考。 目的蛋白沒有掛在親和柱上，可能有四種情況，原因與解決方法如下： 第一種情況：目的蛋白的(His)6標(biāo)簽在重折疊時(shí)沒有位于蛋白質(zhì)分子的表面上，或者由于臨近的空間的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸的空間位阻阻礙了(His)6與Ni形成螯合的共價(jià)鍵。但是一般情況下，帶有（組氨酸）6標(biāo)簽的蛋白質(zhì)與樹脂的結(jié)合并不需要蛋白質(zhì)具有任何功能型結(jié)構(gòu)，即使存在強(qiáng)變性試劑存在時(shí)也如此。 不過可能比較少的時(shí)候蛋白質(zhì)的折疊形態(tài)發(fā)生了改變會(huì)隱藏（組氨酸）6標(biāo)簽，而使得蛋白質(zhì)無法掛柱。這與存在強(qiáng)變性試劑時(shí)（組氨酸）6標(biāo)簽無法隱藏并不矛盾，因?yàn)橛袕?qiáng)變性試劑時(shí)蛋白質(zhì)的肽鏈一般呈伸展?fàn)顟B(tài)，而（組氨酸）6親水性強(qiáng)，且有一定剛性，所以其結(jié)和Ni形成螯合的共價(jià)鍵不會(huì)有太大的空間位阻。但是如果（組氨酸）6被包括在蛋白質(zhì)分子之中，那則另當(dāng)別論了。這樣的包裹（組氨酸）6不是不可能形成。 因?yàn)楸犬吘乖谝患?jí)結(jié)構(gòu)上加了（組氨酸）6標(biāo)簽，一般構(gòu)建時(shí)除了在（組氨酸）6與目的蛋白質(zhì)之間留有凝血酶等酶切位點(diǎn)外，適當(dāng)?shù)倪�要留下幾個(gè)親水的氨基酸殘基的空檔，以免影響目的蛋白質(zhì)的正常折疊。因?yàn)楦鶕?jù)蛋白質(zhì)折疊的拼圖”模型（Jigsaw model）：組成蛋白質(zhì)的絕大多數(shù)氨基酸決定其折疊，替換其中的少數(shù)（≤5%）的氨基酸殘基，蛋白質(zhì)折疊形成的最終構(gòu)象不會(huì)發(fā)生改變 Jigsaw model可能有三種敘述： a. 每一種蛋白質(zhì)可以有不同的折疊路徑，2003年S. Giant 等.報(bào)道：Cytochrome C551有平行的折疊路徑。 b.組成蛋白質(zhì)的絕大多數(shù)氨基酸決定其折疊，替換其中的少數(shù)（≤5%）的氨基酸殘基，蛋白質(zhì)折疊形成的最終構(gòu)象不會(huì)發(fā)生改變。 c.組成蛋白質(zhì)的氨基酸中那些處于疏水核中的氨基酸殘基，與其鄰近的其他的氨基酸殘基的電荷相互作用和空間楔合，對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊和構(gòu)象穩(wěn)定性起到了決定性作用。第二種情況：你用buffer不適合目的蛋白的(His)6與Ni形成螯合的共價(jià)鍵。 第二種情況是溶液環(huán)境的影響了蛋白質(zhì)的折疊形態(tài)，使得目的蛋白的(His)6標(biāo)簽在折疊時(shí)沒有位于蛋白質(zhì)分子的表面上。影響因素：如pH，離子強(qiáng)度，其他蛋白質(zhì)分子，緩沖溶液類型，有關(guān)影響蛋白質(zhì)分子表面的試劑等。 以上兩種情況的解決方法：增加所提的蛋白質(zhì)樣品的溶解度，樓主可考慮一下：比如適量增加變性試劑濃度或類型使得蛋白質(zhì)的肽鏈松散開暴露出（組氨酸）6標(biāo)簽。另外，還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表面活性劑的濃度或類型，加大DTT濃度（DTT濃度<1mmol/L，否則DTT會(huì)與Ni2+結(jié)合），適當(dāng)調(diào)整調(diào)高鹽濃度（氯化鈉溶液低于2mol/L，從低濃度到高濃度逐漸分梯度上升），總之，作用就是增加蛋白質(zhì)的可溶性，因?yàn)椋ńM氨酸）6的親水性較強(qiáng)，增加可溶性之后（組氨酸）6容易暴露在水相。加大DTT濃度也可以切斷二硫鍵使得蛋白質(zhì)的肽鏈松散，進(jìn)而使（組氨酸）6容易暴露在水相。 第三種情況，有比鄰的組氨酸的污染蛋白質(zhì)與Ni-NTA柱結(jié)合，而使得帶有(His)6標(biāo)簽的目的蛋白沒有了結(jié)合位點(diǎn)。第三種情況的解決方法：通過降低洗脫液pH值使得His質(zhì)子化而使得污染蛋白質(zhì)從層析住上被洗脫，一般有比鄰的組氨酸的污染蛋白質(zhì)不太可能有(His)6的序列，所以逐漸降低洗脫液pH值時(shí)，比鄰的組氨酸的污染蛋白質(zhì)會(huì)先被洗脫，而帶有(His)6標(biāo)簽的目的蛋白會(huì)后被洗脫下來。即使這樣估計(jì)錯(cuò)了，但是至少我們能夠確定：有(His)6的序列的目的蛋白質(zhì)與不帶有有(His)6的序列的污染蛋白質(zhì)被洗脫下來的pH值肯定不一樣，所以可以多分些pH值洗脫，對(duì)應(yīng)不同的洗脫峰我們總可以得到目的蛋白質(zhì)。如果污染蛋白質(zhì)含量大，而目的蛋白質(zhì)含量小，可以分別將收集的洗脫產(chǎn)物再次過柱，當(dāng)然要鑒定那個(gè)樣品才是目的蛋白質(zhì)，只要用那一批樣品再次過柱。 第四種可能，一些蛋白質(zhì)或DNA與帶有(His)6標(biāo)簽的目的蛋白發(fā)生了非特異性相互作用，而使得帶有(His)6標(biāo)簽的目的蛋白因?yàn)榭臻g位阻或(His)6標(biāo)簽被遮蓋而無法與Ni-NTA柱結(jié)合。這是可以用低濃度的去污劑(濃度不大于2%的Triton X-100或濃度不大于0.5%SDS)洗滌樣品（上樣洗脫時(shí)）；增加洗脫液的鹽濃度（氯化鈉溶液低于2mol/L）；上樣液里加入30%-50%的甘油，已減弱疏水相互作用。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
weizhi1116樓2013-05-06 20:09:33
weizhi111
至尊木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 11470.4
- 散金: 158
- 紅花: 1
- 帖子: 722
- 在線: 123小時(shí)
- 蟲號(hào): 2144809
- 注冊(cè): 2012-11-24
- 專業(yè): 昆蟲學(xué)
7樓2013-05-07 08:15:23
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 weizhi111 的主題更新
| 7 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +3 | 紅衣隱官 2026-03-21 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 279分求調(diào)劑 一志愿211 +13 | chaojifeixia 2026-03-19 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +10 | yy要上岸呀 2026-03-17 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +6 | △小透明* 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
[考研] 二本跨考鄭大材料306英一數(shù)二 +3 | z1z2z3879 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 華東師范大學(xué)-071000生物學(xué)-293分-求調(diào)劑 +3 | 研究生何瑤明 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 280求調(diào)劑 +7 | 咕嚕曉曉 2026-03-18 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿南昌大學(xué)，327分，材料與化工085600 +9 | Ncdx123456 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 330求調(diào)劑 +4 | 小材化本科 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +5 | lucky呀呀呀鴨 2026-03-20 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩297已過四六級(jí)求調(diào)劑推薦 +11 | adaie 2026-03-19 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)求調(diào)劑 +4 | Stella_Yao 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑（0805） +14 | 煙汐憶海 2026-03-16 | 25/1250 |
|
|
|
[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +4 | z1z2z3879 2026-03-14 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085601專碩，總分342求調(diào)劑，地區(qū)不限 +5 | share_joy 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 考研求調(diào)劑 +3 | 橘頌. 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[論文投稿] 有沒有大佬發(fā)小論文能帶我個(gè)二作 +3 | 增銳漏人 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿211 0703方向310分求調(diào)劑 +3 | 努力奮斗112 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +3 | Yanyali 2026-03-15 | 3/150 |
|