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weizhi111至尊木蟲 (正式寫手)
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[求助]
HIS標(biāo)簽的蛋白不掛柱，求助
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我表達(dá)的蛋白純化時蛋白出現(xiàn)在穿透液里，還比較濃，附件中的膠圖從左向右第6個泳道是穿透液，第7，8，9是洗脫下來的蛋白，最后一個泳道是洗脫完后柱子上殘余的（我可能沒有洗脫完全）。穿透液中損失掉的占了大部分， 是因?yàn)榈鞍讙熘缓脝�？有什么方法改進(jìn)一下嗎？說明：我的蛋白是在包涵體中的，我用了8M尿素水溶液過夜溶解，第二天抽濾才上樣的。banding buffer中含有10mM咪唑，洗脫液含有500mM咪唑，這兩種buffer中都加了8M尿素，pH=8.0�？偣�7ml 樣品用了2ml填料。我后來把穿透液重新又用bangding buffe混合，分成了3個柱子（重新加了填料）又過了一遍（搖床上混了好幾個小時），洗脫下來的還是很少。求各位有經(jīng)驗(yàn)的大俠指教！ chunhua brm-3-29.jpg |
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 蛋白表達(dá)純化與檢測 |
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2樓2013-03-31 00:40:54
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4樓2013-03-31 09:38:18
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5樓2013-03-31 19:11:25
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我今天剛錄入好，回答別人的一個類似問題，順便貼在此處，以供參考。 目的蛋白沒有掛在親和柱上，可能有四種情況，原因與解決方法如下： 第一種情況：目的蛋白的(His)6標(biāo)簽在重折疊時沒有位于蛋白質(zhì)分子的表面上，或者由于臨近的空間的一個或者多個氨基酸的空間位阻阻礙了(His)6與Ni形成螯合的共價(jià)鍵。但是一般情況下，帶有（組氨酸）6標(biāo)簽的蛋白質(zhì)與樹脂的結(jié)合并不需要蛋白質(zhì)具有任何功能型結(jié)構(gòu)，即使存在強(qiáng)變性試劑存在時也如此。 不過可能比較少的時候蛋白質(zhì)的折疊形態(tài)發(fā)生了改變會隱藏（組氨酸）6標(biāo)簽，而使得蛋白質(zhì)無法掛柱。這與存在強(qiáng)變性試劑時（組氨酸）6標(biāo)簽無法隱藏并不矛盾，因?yàn)橛袕?qiáng)變性試劑時蛋白質(zhì)的肽鏈一般呈伸展?fàn)顟B(tài)，而（組氨酸）6親水性強(qiáng)，且有一定剛性，所以其結(jié)和Ni形成螯合的共價(jià)鍵不會有太大的空間位阻。但是如果（組氨酸）6被包括在蛋白質(zhì)分子之中，那則另當(dāng)別論了。這樣的包裹（組氨酸）6不是不可能形成。 因?yàn)楸犬吘乖谝患壗Y(jié)構(gòu)上加了（組氨酸）6標(biāo)簽，一般構(gòu)建時除了在（組氨酸）6與目的蛋白質(zhì)之間留有凝血酶等酶切位點(diǎn)外，適當(dāng)?shù)倪�要留下幾個親水的氨基酸殘基的空檔，以免影響目的蛋白質(zhì)的正常折疊。因?yàn)楦鶕?jù)蛋白質(zhì)折疊的拼圖”模型（Jigsaw model）：組成蛋白質(zhì)的絕大多數(shù)氨基酸決定其折疊，替換其中的少數(shù)（≤5%）的氨基酸殘基，蛋白質(zhì)折疊形成的最終構(gòu)象不會發(fā)生改變 Jigsaw model可能有三種敘述： a. 每一種蛋白質(zhì)可以有不同的折疊路徑，2003年S. Giant 等.報(bào)道：Cytochrome C551有平行的折疊路徑。 b.組成蛋白質(zhì)的絕大多數(shù)氨基酸決定其折疊，替換其中的少數(shù)（≤5%）的氨基酸殘基，蛋白質(zhì)折疊形成的最終構(gòu)象不會發(fā)生改變。 c.組成蛋白質(zhì)的氨基酸中那些處于疏水核中的氨基酸殘基，與其鄰近的其他的氨基酸殘基的電荷相互作用和空間楔合，對于蛋白質(zhì)的折疊和構(gòu)象穩(wěn)定性起到了決定性作用。第二種情況：你用buffer不適合目的蛋白的(His)6與Ni形成螯合的共價(jià)鍵。 第二種情況是溶液環(huán)境的影響了蛋白質(zhì)的折疊形態(tài)，使得目的蛋白的(His)6標(biāo)簽在折疊時沒有位于蛋白質(zhì)分子的表面上。影響因素：如pH，離子強(qiáng)度，其他蛋白質(zhì)分子，緩沖溶液類型，有關(guān)影響蛋白質(zhì)分子表面的試劑等。 以上兩種情況的解決方法：增加所提的蛋白質(zhì)樣品的溶解度，樓主可考慮一下：比如適量增加變性試劑濃度或類型使得蛋白質(zhì)的肽鏈松散開暴露出（組氨酸）6標(biāo)簽。另外，還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表面活性劑的濃度或類型，加大DTT濃度（DTT濃度<1mmol/L，否則DTT會與Ni2+結(jié)合），適當(dāng)調(diào)整調(diào)高鹽濃度（氯化鈉溶液低于2mol/L，從低濃度到高濃度逐漸分梯度上升），總之，作用就是增加蛋白質(zhì)的可溶性，因?yàn)椋ńM氨酸）6的親水性較強(qiáng)，增加可溶性之后（組氨酸）6容易暴露在水相。加大DTT濃度也可以切斷二硫鍵使得蛋白質(zhì)的肽鏈松散，進(jìn)而使（組氨酸）6容易暴露在水相。 第三種情況，有比鄰的組氨酸的污染蛋白質(zhì)與Ni-NTA柱結(jié)合，而使得帶有(His)6標(biāo)簽的目的蛋白沒有了結(jié)合位點(diǎn)。第三種情況的解決方法：通過降低洗脫液pH值使得His質(zhì)子化而使得污染蛋白質(zhì)從層析住上被洗脫，一般有比鄰的組氨酸的污染蛋白質(zhì)不太可能有(His)6的序列，所以逐漸降低洗脫液pH值時，比鄰的組氨酸的污染蛋白質(zhì)會先被洗脫，而帶有(His)6標(biāo)簽的目的蛋白會后被洗脫下來。即使這樣估計(jì)錯了，但是至少我們能夠確定：有(His)6的序列的目的蛋白質(zhì)與不帶有有(His)6的序列的污染蛋白質(zhì)被洗脫下來的pH值肯定不一樣，所以可以多分些pH值洗脫，對應(yīng)不同的洗脫峰我們總可以得到目的蛋白質(zhì)。如果污染蛋白質(zhì)含量大，而目的蛋白質(zhì)含量小，可以分別將收集的洗脫產(chǎn)物再次過柱，當(dāng)然要鑒定那個樣品才是目的蛋白質(zhì)，只要用那一批樣品再次過柱。 第四種可能，一些蛋白質(zhì)或DNA與帶有(His)6標(biāo)簽的目的蛋白發(fā)生了非特異性相互作用，而使得帶有(His)6標(biāo)簽的目的蛋白因?yàn)榭臻g位阻或(His)6標(biāo)簽被遮蓋而無法與Ni-NTA柱結(jié)合。這是可以用低濃度的去污劑(濃度不大于2%的Triton X-100或濃度不大于0.5%SDS)洗滌樣品（上樣洗脫時）；增加洗脫液的鹽濃度（氯化鈉溶液低于2mol/L）；上樣液里加入30%-50%的甘油，已減弱疏水相互作用。 |
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weizhi1116樓2013-05-06 20:09:33
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