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[求助] PCR擴(kuò)增水稻未知基因反轉(zhuǎn)錄

水稻，一段未知功能的序列 2.8K長(zhǎng) cDNA 用ACTIN檢測(cè) 質(zhì)量較好引物是頭尾個(gè)20bp 加上酶切位點(diǎn)NHEI 和 BGLII和保護(hù)堿基用的Takara的PRIMERSTAR GXL 和takara的普通酶完全擴(kuò)不出來(lái) 換成DNA 還是擴(kuò)不出來(lái)

。請(qǐng)問(wèn)各位大神是什么原因，解決方法？
還有個(gè)問(wèn)題拉某一段2.8K 已知cDNA的全長(zhǎng), 用一般的反轉(zhuǎn)試劑盒是不是可以還是一定要用RACE嗎？求各位能給予幫助！謝謝啦！

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1樓 2013-04-01 19:26:06

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剛才不會(huì)上傳圖片，現(xiàn)附上圖片。請(qǐng)各位師兄師姐幫幫忙！

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2樓2013-04-02 16:23:36

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剛才稍調(diào)整了下圖片�，F(xiàn)在再次上傳圖片。

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3樓2013-04-02 16:29:09

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你這種情況，需要優(yōu)化下引物，不一定要先加上酶切位點(diǎn)，你可以先將包含有你基因ORF的cDNA擴(kuò)出來(lái)，構(gòu)建到T載體等中間載體上，再設(shè)計(jì)引物擴(kuò)CDS做表達(dá)或者其他用途，所以我的建議是重新設(shè)計(jì)引物，引物可以設(shè)計(jì)在你基因的5‘和3’UTR里面

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4樓2013-04-02 19:40:26

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4樓: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 19:40:26
你這種情況，需要優(yōu)化下引物，不一定要先加上酶切位點(diǎn)，你可以先將包含有你基因ORF的cDNA擴(kuò)出來(lái)，構(gòu)建到T載體等中間載體上，再設(shè)計(jì)引物擴(kuò)CDS做表達(dá)或者其他用途，所以我的建議是重新設(shè)計(jì)引物，引物可以設(shè)計(jì)在你基因 ...

謝謝gyesang你,再請(qǐng)教下：1，可是這是一段未知功能的基因， NCBI上只有單純的 CDS 沒(méi)有UTR？2，CDNA的質(zhì)量和這個(gè)有沒(méi)有關(guān)系？

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5樓2013-04-02 21:57:14

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引用回帖:

5樓: Originally posted by xiaowoodworm at 2013-04-02 21:57:14
謝謝gyesang你,再請(qǐng)教下：1，可是這是一段未知功能的基因， NCBI上只有單純的 CDS 沒(méi)有UTR？2，CDNA的質(zhì)量和這個(gè)有沒(méi)有關(guān)系？...

如果只有CDS序列，那的確，引物就不好優(yōu)化了

cDNA的質(zhì)量當(dāng)然是有很大關(guān)系的，要保證cDNA的質(zhì)量，就要在mRNA的質(zhì)量上嚴(yán)加控制

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6樓2013-04-03 01:02:37

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6樓: Originally posted by gyesang at 2013-04-03 01:02:37
如果只有CDS序列，那的確，引物就不好優(yōu)化了

cDNA的質(zhì)量當(dāng)然是有很大關(guān)系的，要保證cDNA的質(zhì)量，就要在mRNA的質(zhì)量上嚴(yán)加控制...

謝謝啦！

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7樓2013-04-10 21:19:18

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