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沒(méi)入塵埃5金蟲 (小有名氣)
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[求助]
熒光定量PCR與普通PCR
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| 我們實(shí)驗(yàn)室做檢測(cè)時(shí)都是先用普通PCR檢測(cè)，看著條帶好再用實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，有一個(gè)基因在瓊脂糖凝膠上看著條帶是單一的，為什么在做熒光定量的時(shí)候溶解曲線是這樣的呢？請(qǐng)大家多多幫助，十分感謝~~~ |
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2013-04-02 15:21:16, 54.8 K
2013-04-02 15:21:22, 48.47 K
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
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沒(méi)入塵埃5
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)應(yīng)助！ 2013-04-02 19:19:26
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| 普通PCR檢測(cè)靈敏度比熒光定量差很多。能看到條帶時(shí)早就過(guò)了熒光定量的檢測(cè)限。所以，即使普通PCR上是一條帶，不一定說(shuō)明熒光定量時(shí)候效果就很好。此外，熒光定量的酶和體系與普通PCR的不一樣，普通PCR優(yōu)化的最佳退火溫度與熒光定量時(shí)未必一樣。感覺(jué)你需要優(yōu)化熒光定量PCR的反應(yīng)程序。如果實(shí)在不行的話，說(shuō)明可能需要更換引物。 |
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沒(méi)入塵埃52樓2013-04-02 15:38:08
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3樓2013-04-02 18:16:32
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【答案】應(yīng)助回帖
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做熒光定量一般不看普通PCR的效果，的確是因?yàn)槠胀≒CR結(jié)果好也根本不說(shuō)明什么問(wèn)題。但是，如果普通PCR顯示有兩條帶，說(shuō)明產(chǎn)物不單一，應(yīng)該算是有問(wèn)題吧。不知道你說(shuō)的應(yīng)該定量的熔接曲線好是什么意思。我覺(jué)得一般情況下普通PCR能P出兩條帶的話，熒光定量的熔接曲線應(yīng)該很難是單一的銳峰。 |
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4樓2013-04-02 22:32:39
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